核黃素四丁酸酯抗焦慮作用的藥效學研究

于文瀟，趙 德，鄧 君

(1.西南大學藥學院，重慶 400716;2.北大國際醫院集團重慶大新藥業股份有限公司，重慶 400700)

焦慮癥是一種常見的精神類疾病，隨著社會壓力的日趨激烈，其發病率逐年升高［1］。目前臨床常用的抗焦慮和抗抑郁藥物有諸多不良反應，如:頭昏、停藥后復發、認知障礙、藥物依賴等［2］，因此研發療效好、針對性強、副作用少的抗焦慮和抗抑郁藥物成為近年的研究熱點［3］。

有報道稱維生素等營養物質的匱乏可能導致焦慮抑郁等精神疾病，因此在相應的藥物治療中添加維生素(尤其是復合維生素B族)，可達到更佳的治療效果［4］。研究表明，維生素 B2對產后抑郁癥有一定療效［5］，維生素B2還可加強三環類抗抑郁藥治療伴有認知功能障礙的老年抑郁癥［6］。

核黃素四丁酸酯(RTB)是維生素B2的衍生物，一直被用作降血脂藥物(維脈寧)，具有抑制血小板聚集和增加纖維蛋白溶解活性的作用，用于高血脂、冠心病和血栓性疾病的治療［7］。RTB對精神疾病的藥理活性尚未見報道，本文采用行為藥理學的實驗方法初步考察RTB的抗焦慮藥理作用。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級昆明種小鼠，♂，8周齡，體重18～24 g，購買于第三軍醫大學實驗動物中心。自由攝食飲水。光照節律12L:12D(7:00～19:00)，室溫(25±2)℃。環境安靜。每只動物只用1次。

1.2 藥物與試劑 ① RTB:由重慶大新藥業股份有限公司提供;臨用前用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液混懸均勻，避光保存。②地西泮靜脈注射液:SWJ?，湖北制藥有限公司，批號09070001;用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液稀釋成所需濃度，新鮮配制，4℃保存。③ 鹽酸丁螺環酮片，江蘇恩華藥業股份有限公司，生產批號:20100202。配制方法同上。④羧甲基纖維素鈉:成都科龍化工試劑廠，批號:20090402。

1.3 主要儀器 高架十字迷宮(elevated plusmaze，EPM):兩個開臂(長30 cm，寬5 cm)與兩個閉臂(長30 cm，寬5 cm，高15 cm)相互垂直，中央平臺5 cm×5 cm。迷宮距離地面50 cm。PM-200十字迷宮跟蹤分析系統，成都泰盟科技有限責任公司。YLS-4C型轉棒式疲勞儀，山東省醫學科學院設備站。

2 方法

2.1 動物分組 動物適應飼養3 d，按體重隨機分為RTB高、中、低劑量組、地西泮組、丁螺環酮組和空白組。EPM實驗和新型食物消耗實驗，每組動物15只;轉棒實驗，每組動物10只。

2.2 給藥方式 一次性灌胃給藥。按照人與動物的體表面積計算法換算出RTB高、中、低劑量組分別為 80、40、20 mg·kg－1，約相當于人給藥劑量 10、5、2.5 mg·kg－1;地西泮按 2 mg·kg－1給藥，丁螺環酮按5 mg·kg－1給藥;空白組灌服等容積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。RTB組、丁螺環酮組和空白組給藥1 h后，地西泮組給藥0.5 h后，進行行為學測試，測試時間為9:00～15:30。

2.3 小鼠高架十字迷宮實驗［8］所有動物提前2 h進入測試實驗室。測試前將每只小鼠放入1個60 cm×60 cm×35 cm塑料盒中，自由探究5 min，然后迅速置于EPM的中央平臺，頭朝一開臂，放開，由跟蹤分析系統自動記錄5 min內小鼠分別進入開臂的次數(open arm entry，OE，以小鼠4只爪子均進入到臂內為準)和進入閉臂的次數(close arm entry，CE，同上)以及分別在開臂內的滯留時間(open arm time，OT，單位:s)和在閉臂內的滯留時間(close arm time，CT，單位:s)，計算出:① 進入開臂和閉臂的總次數(OE+CE)，作為小鼠運動活力(locomotor activity)的評價指標;② 開臂進入次數百分比(OE%)，即OE/(OE+CE)×100%;③ 開臂滯留時間百分比(OT%)，即 OT/(OT+CT)×100%［9］;OE%和OT%作為抗焦慮作用的指標。每只小鼠測試完畢后用酒精擦拭迷宮，排除氣味對下只小鼠的干擾。

2.4 小鼠新型食物消耗實驗(novel food consumption test)［10］實驗前所有小鼠禁食16 h。給藥一定時間后，每只小鼠置于一干燥潔凈的塑料盒(24 cm×10 cm×8 cm)中。每個盒中同一位置放入一直徑9 cm的表面皿，內盛定量新型食物(鼠料粉∶色拉油=2∶1)。記錄每只小鼠5 min內的食物消耗量，計算小鼠每克體重消耗食物的量，以mg·g－1表示。

2.5 轉棒實驗(rota-rod test)［11］實驗前1 d訓練所有實驗動物，能在轉桿上停留5 min的動物進入第2天的測試，排除不達標者。實驗時將小鼠放于直徑7 cm的轉桿上，轉速為10 r·min－1。分別在給藥1 h、3 h、6 h和24 h后將小鼠置于轉桿上，記錄各組小鼠在1 min內的跌落只數，計算成功率(成功率/%=未跌落小鼠數/每組小鼠總數×100%)。

3 結果

3.1 小鼠高架十字迷宮實驗 EPM實驗結果(Tab 1)表明，與空白對照組比較，各給藥組的總入臂次數(OE+CE)沒有明顯變化，提示各組藥物均未改變動物的活動能力。地西泮和丁螺環酮組均明顯地增加小鼠OE%和OT%值。RTB各劑量組的OE%和OT%值均較空白組增加，且20和40 mg·kg－1組與空白組比較差異有顯著性，說明低劑量和中劑量RTB在EPM模型上顯示出抗焦慮作用。

Tab 1 Effect of RTB on the behavior of mice in EPM(± s，n=15)

Tab 1 Effect of RTB on the behavior of mice in EPM(± s，n=15)

DZP:diazepam;RTB:riboflavin tetrabutyrate;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control

Group Dose/mg·kg－1OE+CE OE% OT%Control － 12.06±8.05 34.42 ±17.24 34.77±18.90 DZP 2 15.26±11.02 50.50 ±15.83＊＊ 59.11±20.65＊＊Buspirone 5 11.00±6.96 48.07 ±19.96* 49.47±22.20 RTB 20 13.40±4.87 46.71 ±16.15* 49.62±17.51*40 13.53±4.32 49.60 ±16.44* 50.18±18.53*80 12.86±8.01 42.26 ±12.88 41.00±11.56

3.2 小鼠新型食物消耗實驗 結果(Tab 2)顯示，地西泮能增加小鼠在新奇環境中對新型食物的消耗量，但丁螺環酮對小鼠新型食物消耗量的增加未達到統計學意義。RTB各劑量組小鼠單位體重的食物消耗量均較空白組增加，且40和80 mg·kg－1組與空白組比較差異有顯著性(P＜0.05)，即在小鼠新型食物消耗實驗中，RTB在中劑量和高劑量時表現出抗焦慮作用。

3.3 小鼠轉棒實驗 結果(Tab3)顯示，與空白組比較，地西泮和丁螺環酮導致小鼠從轉棒上的跌落率增加，提示地西泮和丁螺環酮對受試動物的運動協調性有損傷。而RTB各組小鼠的跌落率沒有明顯變化，說明RTB在所給劑量下單次給藥，對小鼠的肌肉協調能力沒有明顯損害作用。

Group Dose/mg·kg－1 Consumption of novel food/mg·kg －1 Control － 6.78 ±2.73 DZP 2 10.42 ±4.30＊＊Buspirone 5 8.55 ±2.89 RTB 20 8.26 ±4.48 40 10.20 ±2.94*80 9.93 ±4.11*

DZP:diazepam;RTB:riboflavin tetrabutyrate;*P＜0.05，＊＊P＜0.01vscontrol

Tab 3 Effect of RTB on the rate of falling from rota-rod of the mice(n=10)

4 討論

EPM為國際公認的測試動物焦慮行為的首選模型，它利用動物對新奇環境的探究習性與對高懸敞開臂的恐懼，形成動物的矛盾沖突心理，通過動物的行為表現考察動物的焦慮情緒［12］。OE%和OT%反映了動物趨近－規避沖突的結果，與焦慮程度直接相關，抗焦慮藥物可以使OE%和OT%增高;而開臂和閉臂的總進入次數反映了動物的活動能力。新型食物消耗實驗也是篩選抗焦慮藥物的經典行為藥理學模型，利用動物在新奇環境中的逃避心理和對誘人食物的享用欲望形成矛盾沖突，使動物產生焦慮情緒。抗焦慮作用的藥物可以翻轉陌生環境對攝食行為的抑制，縮短動物對新型食物消耗的潛伏期及增加對食物的消耗量［13］。

EPM實驗中，RTB各劑量組小鼠的活動能力無明顯改變，但OE%和OT%均較空白組增加，且20和40 mg·kg－1劑量組差異有顯著性，但作用不如地西泮。新型食物消耗實驗中，RTB 40和80 mg·kg－1劑量能明顯增加動物單位體重的食物消耗量。上述結果均表明，RTB具有抗焦慮作用，且在40 mg·kg－1劑量下抗焦慮效果最優。

上述實驗結果中，苯二氮卓類抗焦慮藥物地西泮的抗焦慮效果最優，但轉棒實驗中其對動物的肌肉協調能力損害最大;5-HT1A受體激動劑的代表藥物丁螺環酮的抗焦慮效果不如地西泮，可能因為其作用效果緩慢且需要多次用藥［14］，而本研究中采用單次給藥且用藥時間短，導致其未完全發揮出抗焦慮作用。RTB雖然抗焦慮作用不及地西泮，但對受試動物的肌肉協調能力無明顯損傷，且該藥物在降血脂應用中未表現出明顯毒副作用，有望成為一種安全的新型抗焦慮藥物。

RTB的抗焦慮機制可能是通過其前體化合物核黃素(維生素B2，Vit B2)起作用。Vit B2是黃素蛋白的輔酶FMN和FAD的核心組成成分，是重要的電子傳遞體，參與細胞呼吸過程，且為其他多種細胞過程所需［15］。Vit B2還影響其他維生素的作用，如Vit B6轉化為其活性形式磷酸吡哆醛就必需Vit B2的參與。而磷酸吡哆醛是多種神經遞質體內合成關鍵酶的輔酶，如催化色氨酸合成5-羥色胺(5-HT)的色氨酸脫羧酶、催化谷氨酸鹽轉化為γ-氨基丁酸(γ-GABA)的L-谷氨酸脫羧酶等均以磷酸吡哆醛為輔酶［16］，故 Vit B2對于維持抑制性神經遞質——5-HT、GABA的正常水平是必需的。此外，興奮性神經遞質去甲腎上腺素(NA)的代謝失活需要單胺氧化酶(MAO)，而MAO是黃素蛋白酶，其催化活性需要Vit B2的直接作用［17］。所以，Vit B2是神經系統發揮正常功能的保證，其缺乏會導致精神緊張，甚至出現認知障礙、神經退行性病變和周圍神經病［18］。Carney 等［19］發現，Vit B2的缺乏與精神疾病明顯相關。

Vit B2是水溶性維生素，可隨尿液和汗液排泄，故需每日補充。正是因為Vit B2的強親水性，使其不能被動擴散通過細胞膜進入細胞，而需要轉運蛋白的主動運輸［20］。而主動運輸與轉運蛋白的量和活性成正相關，是可飽和的，故對那些轉運蛋白表達量不足或活性較低的人群，即使補充Vit B2，也容易導致Vit B2缺乏。而RTB是Vit B2的酯化衍生物，具強脂溶性，可能不需要通過轉運蛋白直接依賴濃度差擴散進入細胞，尤其是神經細胞，形成細胞的Vit B2庫，保證細胞對Vit B2的需求，維持細胞的最佳生理狀態。所以，RTB至少可以作為Vit B2的前體藥物，發揮預防焦慮和緩解焦慮癥狀的作用，而且對于核黃素轉運蛋白表達低或活性低的群體，其對焦慮癥的緩解作用大于Vit B2。

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