玉郎傘皂苷對四氯化碳誘導大鼠肝纖維化的影響

郭又嘉，文 坎，張士軍，吳 咖，黃仁彬

(廣西醫(yī)科大學藥理學教研室，廣西南寧 530021)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的中間病理階段，慢性肝病大多數都有肝纖維化，其中25%～40%最終發(fā)展成肝硬化甚至肝癌［1］。玉郎傘(YLS)為豆科植物疏葉崖豆［Millettia Pulchra kurz var.laxior(Dunn)Z.Wei］的干燥根，始見于《廣西中藥志》，為廣西壯、瑤醫(yī)常用藥材。迄今國內外只有本課題組對其進行提取分離及相關藥理、藥效研究［2］。而玉郎傘皂苷(YLSS)為YLS的一個分離部位，前期研究表明其具有抗自由基、抗高血壓、保護離體心血管、保護大腦缺血/再灌注損傷等作用［3－5］，但尚未見其抗肝纖維化的報道。而自由基可使肝星狀細胞激活，促進Ⅰ型膠原合成，引發(fā)肝臟的纖維化反應［6］，本文以YLSS為研究對象，探討其對HF的保護作用及機制。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠，體質量150～180 g，♀♂各55只，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。試驗動物使用許可證:SCXK桂2009-0002。

1.2 藥物及試劑 四氯化碳(AR，成都市科龍化工試劑廠，批號20100925)、食用油(嘉里糧油有限公司，SB/T 10292)、玉郎傘皂苷(簡稱YLSS，由本實驗室自行提取，提取率為1.49%)、秋水仙堿片(西雙版納藥業(yè)有限責任公司，批號110403);試劑盒:分別為AST(批號20110312)、ALT(批號20110317)、考馬 斯 亮 藍 (批 號 20110321)、SOD(批 號20110728)、MDA(批號 20110716)、GSH(批號20110816)和GSH-Px(批號20110816)試劑盒，均為南京建成生物工程研究所生產。

1.3 實驗儀器 主要實驗儀器設備有:TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、CL17R低溫高速離心機(北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司)。

2 方法

2.1 CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型的建立 將♀♂SD大鼠分籠飼養(yǎng)，適應環(huán)境5 d后分別隨機分成兩組:肝纖維化模型組及正常對照組。肝纖維化模型組♀♂大鼠分別為♀50只、♂44只，均以50%CCl4食用油溶液1 ml·kg－1灌胃，每周稱重并灌胃2次，按實際體重調整給藥劑量［7］;正常對照組♀♂大鼠均為10只，共20只給予NS灌胃，劑量及給藥方法同肝纖維化模型組。造模第7、8周，將♂大鼠麻醉，固定，于腋前線第8肋間進針，刺入肝臟0.5～0.8 cm，拔出穿刺針，取出肝組織條置10%甲醛固定［8］;第9、10周對♀大鼠進行肝臟穿刺，操作同上。

2.2 實驗分組及用藥［9］將確認形成肝纖維化的大鼠隨機分為5組:給藥組共4組，每組♀♂各8只;模型對照組1組，♀♂各10只;加上空白對照組♀♂各10只，共6組。陽性組給予秋水仙堿0.2 mg·kg－1;YLSS 高、中、低劑量組(YLSSH、YLSSM、YLSSL)分別給予 YLSS 80、40、20 mg·kg－1;空白對照組和模型對照組給予NS 10 ml·kg－1。各組動物在相同條件下飼養(yǎng)，均以每日1次、空腹灌胃，連續(xù)給藥4周。除空白對照組外，其余各組均繼續(xù)給予50%CCl4油溶液(同造模方法)。

2.3 樣本制備 末次給藥禁食不禁水24 h后，腹腔注射戊巴比妥納30 mg·kg－1麻醉，腹主動脈取血，4℃離心分離血清，－20℃保存，用于 ALT、AST的測定。取肝組織做10%勻漿后于－80℃冰箱保存，用于 SOD、MDA、GSH、GSH-Px及考馬斯亮藍的測定;于肝左葉同一部位取肝組織約(1×1×1)cm3大小，固定于10%甲醛溶液，做光鏡觀察。

2.4 指標測定 血清中ALT(賴氏法)、AST(賴氏法)和肝組織總蛋白含量、GSH、GSH-Px、SOD、MDA的檢測均嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.5 肝組織病理學檢查 各組大鼠肝臟標本以10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，經石蠟包埋后切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織纖維化程度。

2.6 數據處理 數據的計算采用Excel表格法。而標準曲線的擬合及數據的統(tǒng)計分析，則以α=0.05為檢驗水準，應用SPSS 13.0軟件分析:計量資料數據均以±s表示，采用單因素方差分析法處理(經方差齊性檢驗，方差齊者采用LSD法進行組間兩兩比較，方差不齊者采用Games-Howell法進行兩兩比較);計數資料采用秩和檢驗。

Tab 1 Effect of YLSS on the activity of ASTand ALT in the serum of rats(±s)

Tab 1 Effect of YLSS on the activity of ASTand ALT in the serum of rats(±s)

＊＊P ＜0.01 vs model control group;ΔΔP ＜0.01 vs normal control group

Group n AST/IU·L－1 ALT/IU·L －1 YLSSL 14 148.90 ±12.11ΔΔ＊＊ 49.85 ±3.31＊＊YLSSM 14 129.93 ±4.72ΔΔ＊＊ 46.38 ±14.20＊＊YLSSH 15 117.65 ±11.19＊＊ 41.37 ±7.10＊＊Colchicine 15 139.62 ±34.18＊＊ 53.14 ±15.07＊＊Model control 16 361.95 ±61.57ΔΔ 105.78 ±59.18ΔΔ Normal control 20 109.86 ±9.69＊＊ 38.96 ±5.95＊＊

3 結果

3.1 YLSS對肝纖維化大鼠血清AST、ALT的影響 與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清AST與ALT的含量升高(P＜0.01)，YLSS低、中劑量組AST含量亦與空白組差別有顯著性(P＜0.01)。而與模型組比較，YLSS各劑量組和陽性組大鼠血清AST和ALT含量均降低(P＜0.01)。見Tab 1。

3.2 YLSS對肝纖維化大鼠肝組織SOD、MDA、GSH、GSH-Px的影響 與空白組比較，模型對照組大鼠肝組織中SOD、GSH-Px及GSH明顯降低(P＜0.01)，MDA含量明顯升高(P＜0.01);而YLSS中、高劑量組的GSH-Px增高(P＜0.01)。與模型組比較，YLSS各劑量組與陽性組均可升高肝纖維化大鼠血清SOD及GSH活力(P＜0.01或P＜0.05)，降低肝纖維化大鼠肝組織MDA含量(P＜0.01);YLSS各劑量組肝組織中GSH-Px活力升高(P＜0.01)。陽性對照組GSH-Px活力與模型對照組及空白對照組比較差別均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。而隨著給藥劑量的增高，YLSS提升SOD能力逐漸升高，但降低MDA的能力有所降低(Tab 2)。

Tab 2Effects of YLSS on the levels of SOD，MDA，GSH-Px，GSH in the liver tissue(±s)

Tab 2Effects of YLSS on the levels of SOD，MDA，GSH-Px，GSH in the liver tissue(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model control group;ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01 vs normal control group

Group n SOD/kU·g－1Pro MDA/μmol·g－1Pro GSH-Px/μmol·g－1Pro GSH/μmol·g－1Pro YLSSL 14 131.72 ±31.76* 1.16 ±0.29Δ＊＊ 750.87 ±41.37＊＊ 4.95 ±0.27ΔΔ*YLSSM 14 138.36 ±22.08＊＊ 1.43 ±0.50＊＊ 851.80 ±89.37ΔΔ＊＊ 5.30 ±0.42ΔΔ＊＊YLSSH 15 153.73 ±27.31＊＊ 1.47 ±0.40＊＊ 862.91 ±100.10ΔΔ＊＊ 5.83 ±0.65＊＊Colchicine 15 126.64 ±18.88＊＊ 2.00 ±0.41＊＊ 515.65 ±312.03 5.71 ±0.89＊＊MC 16 92.70 ±16.07ΔΔ 3.65 ±0.89ΔΔ 374.12 ±291.96ΔΔ 4.32 ±0.53ΔΔ NC 20 167.55 ±51.82＊＊ 2.04 ±0.78＊＊ 683.37 ±196.29＊＊ 6.58 ±0.44＊＊

3.3 YLSS對肝纖維化大鼠肝組織病理組織學觀察 正常對照組:大鼠肝小葉結構完整，為類圓形，肝細胞排列整齊，表現為肝細胞以中央靜脈為中心，呈放射狀排列，未見變性和壞死;中央靜脈及肝竇未見充血、出血和水腫;匯管區(qū)亦未見纖維組織增生。模型對照組:肝小葉結構被破壞，匯管區(qū)纖維組織明顯增生并伸入小葉將肝小葉分割，形成假小葉，結節(jié)周圍纖維組織增生，少量炎細胞浸潤。YLSSH組:肝細胞排列紊亂，肝小葉結構完整，肝組織匯管區(qū)及小葉內散在點狀、星芒狀纖維組織增生，纖維間隔形成，但小葉結構大部分保存，并伴濁腫變性、脂肪變性。YLSSM及陽性對照組:纖維組織增生，纖維間隔形成，局部可見分隔并破壞肝小葉，大部分肝小葉結構保留，但排列紊亂，而無肝硬化改變。YLSSL組:大量纖維間隔，分隔并破壞肝小葉，致小葉結構紊亂，但尚未形成假小葉。

纖維化程度按2000年中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會，肝病學分會聯合修訂的《病毒性肝炎防治方案》中標準分期，統(tǒng)計結果為:與模型對照組比較，陽性組及YLSS高、中劑量組有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而YLSS低劑量組無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(Tab 3，Fig 1 ～6)。

Tab 3 Effect of YLSS on pathological grade of liver in each group

Fig 1 Hepatic lobule of YLSSLgroup Fig 2 Hepatic lobule of YLSSMgroup Fig 3 Hepatic lobule of YLSSHgroup Fig 4 Hepatic lobule of colchine group Fig 5 Hepatic lobule of model control group Fig 6 Hepatic lobule of nomal control group

4 討論

HF是慢性非自限性肝損傷的后果，存在于幾乎所有類型的慢性肝損傷疾病中［10］。現大多學者認為，肝纖維化的主要機制是在肝臟持續(xù)損傷過程中，一些細胞分泌諸多細胞因子，這些細胞因子使肝星狀細胞(hepatic stelate cels，HSC)活化并轉變?yōu)榧〕衫w維細胞(MFB)，MFB分泌大量膠原并合成細胞外基質(extra celular matrix，ECM)，導致肝纖維化的發(fā)生［11］。現已公認，HF 是可逆性的病變之一［12－14］，若進一步發(fā)展成肝硬化則難以逆轉。

CCl4為目前最為常用的誘導肝損傷的藥物，采取反復多次給藥的方法可制備慢性肝損傷模型。肝損傷主要表現為肝細胞反復的破壞、再生、肝組織結構改變、肝纖維化和肝硬化的發(fā)生［15］。CCl4可經肝細胞的細胞色素P450 Fe2+作用產生超氧陰離子()，并通過自由基反應擴展程序產生三氯甲基自由基(CCl3·)、二氯甲基自由基(CCl2·)和過氧化甲基自由基(CClOO·)等自由基。可轉化為

3H2O2，后者又經鐵離子(Fe3+)促發(fā)Fenton反應生成羥自由基(OH·)。OH·、CCl2·和CCl3OO·等自由基可攻擊膜磷脂中的多不飽和脂肪酸(PUFA)，引發(fā)膜脂質過氧化反應［16］，最終導致MDA形成增多，肝細胞膜通透性增加，ALT與AST大量釋放入血。鏈式反應過程中產生的過氧化物質可引起炎癥反應、刺激庫普弗細胞(kuffer cells)活化，進而促進HSC細胞的活化增殖，導致肝纖維化［17］;另外，CCl3·還可抑制鈣泵［18］，使Ca2+大量滯留于細胞內，以致肝細胞損傷。

本實驗結果表現為，YLSS各劑量組可降低肝纖維化大鼠血清ALT、AST水平和肝組織中MDA含量，提高肝組織中SOD、GSH-Px和GSH活性。該結果提示了YLSS作用機制可能為通過提高 S OD、GSH-Px和GSH含量，增強清除氧自由基能力，抑制肝臟脂質過氧化反應，從而穩(wěn)定肝細胞膜、減輕細胞損傷;而GSH的含量的增高，可能與其提高GSH-Px有關。可見，YLSS可有效地緩解CCl4所致的大鼠肝細胞損傷，并對大鼠肝纖維化具有較好的逆轉作用。

同時，由上文的敘述可知MDA為脂質過氧化的終產物，其含量反映機體脂質過氧化程度。本實驗通過YLSS對體內MDA的影響發(fā)現，隨著給藥濃度的增加MDA含量略有增高，但總體較模型組低。MDA不與劑量呈正相關可能原因有以下方面。一方面，體內的抗氧化有酶系和非酶系統(tǒng)，SOD、GSH-Px及GSH為酶系，而MDA為機體脂質過氧化的終產物，也許不呈正相關與其對抗氧化非酶系統(tǒng)的作用有關;第2方面，本課題組在“玉郎傘多糖和皂苷對氧自由基清除作用研究”中發(fā)現，玉郎傘皂苷在體外并非對所有自由基的生成有抑制及清除作用，其對具有明顯的抑制及清除作用，但對OH·則是促進生成的作用［19］;第3方面，自由基在機體正常生理過程中是存在的，機體是個整體，也許體內自由基的生成和消除體系存在一個負反饋的過程，使之趨于平衡。

綜上所述，YLSS對CCl4所致的大鼠肝纖維化具有一定的抑制作用，機制可能與其抗氧化作用有關，同時其體內過程可能存在更為復雜的交互作用。

［1］Pinzani M，Romanelli R G，Magli S.Progression of fibrosis in chronic liver diseases:time to tally the score［J］.J Hepatol，2001，34(5):764－7.

［2］簡 潔，劉 曦，黃仁彬，等.玉郎傘兩種黃酮單體對心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用［J］.中國藥理學通報，2009，25(7):942－5.

［2］Jian J，Liu X，Huang R B，et al.Protection and its mechanism of two flavone morphons from Yulangsan on hypoxia-reoxygenation induced injury in myocardial cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(7):942－5.

［3］黃仁彬，林 興，蔣偉哲，等.玉郎傘化學成分對自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2006，26(2):130－3.

［3］Huang R B，Lin X，Jiang W Z，et al.Effects of the chemical component of yulangsan on blood pressure in spontaneously hypertensive rats(SHRs)［J］.Chin Hosp Pharm J，2006，26(2):130－3.

［4］呂紀華.玉郎傘提取物對離體心血管的作用及其機制的研究［D］.廣西醫(yī)科大學，2007.

［4］Lü J H.Effect and actionmechanism of yulangsan extractson cardiovascular system of ratsin vitro［D］.Guangxi Med Univ，2007.

［5］陳 健.玉郎傘多糖對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用［D］.廣西醫(yī)科大學，2008.

［5］Chen J.Protective effect of yulangsan polysaccharide on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats［D］.Guangxi Med Univ，2008.

［6］Sanmugapriya E，Venkataraman S.Studies on hepatoprotective and antioxidant actions of Strychnos potatorum Linn.seeds on CCl4-induced acute hepatic injury in experimental rats［J］.J Ethnopharmacol，2006，105(1－2):154－60.

［7］Constandinou C，Henderson N，Iredale J P.Modeling liver fibrosis in rodents［J］.Methods Mol Med，2005，117:237－50.

［8］黃新立，張 峰，王學浩，等.建立大鼠部分肝移植動脈化模型的實驗研究［J］.中國普外基礎與臨床雜志，2004，11(3):224－7.

［8］Huang X L，Zhang F，Wang X H，et al.Research of partial liver transplantation with hepatic arterialization in rats［J］.Chin J Bases Clin General Surg，2004，11(3):224－7.

［9］陳兆霓，張士軍，唐愛存.六月青皂苷對四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21(8):1911－2.

［9］Chen Z N，Zhang S J，Tang A C.The effect of liuyueqing saponins on liver fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats［J］.Lishizhen Med Mat Med Res，2010，21(8):1911－2.

［10］Williams R.Global challenges in liver disease［J］.Hepatology，2006，44(3):521－6.

［11］Benyon R C，Iredale J P.Is liver fibrosis reversible E［J］.Gut，2000(46):443－6.

［12］孔德松，鄭仕中，陸 茵.肝內肌成纖維細胞的來源及其在肝纖維化中作用的研究［J］.中國藥理學通報，2011，27(3):297－300.

［12］Kong D S，Zheng S Z，Lu Y，et al.Research progress on myofibroblasts:their sources and roles in liver fibrogenesis［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(3):297－300.

［13］Pinzani M，Rombouts K.Liver fibrosis:from the bench to clinical targets［J］.Dig Liver Dis，2004，36(4):231－42.

［14］Lamireau T，Desmouliere A，Bioulac-Sage P，et al.Mechanisms of hepatic fibrogenesis［J］.Arch Pediatr，2002，9(4):392－405.

［15］張海燕，溫 韜，盧 靜，等.四氯化碳誘導大鼠慢性肝損傷模型方法的探討［J］.實用肝臟雜志，2009，12(3):161－3.

［15］Zhang H Y，Wen T，Lu J，et al.Establishment of CCl4-induced chronic liver injury model in rats［J］.J Clin Hepatol，2009，12(3):161－3.

［16］段小群.玉郎傘多糖(YLS)抗肝纖維化作用及機制的研究［D］.廣西醫(yī)科大學，2006.

［16］Duan X Q.Porteetive effects and meehanisms of yulangsan polysaccharide(YLS)on hepatic fibrosis［D］.Guangxi Med Univ，2006.

［17］黃 艷，黃 成，李 俊.肝纖維化病程中Kupffer細胞分泌的細胞因子對肝星狀細胞活化增殖、凋亡的調控［J］.中國藥理學通報，2010，26(1):9－13.

［17］Huang Y，Huang C，Li J.Effect of cytokines secreted from Kupfer cell on HSC proliferation，apoptosis in hepatic fibrosis process［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(1):9－13.

［18］徐 鑫，屈彩芹.藥物性肝損傷機制［J］.醫(yī)學綜述，2008，14(5):747－9.

［18］Xu X，Qu C Q.Mechanisms of drug-induced liver injury［J］.Med Recap，2008，14(5):747－9.

［19］陳 健，黃媛恒，王乃平，等.玉郎傘多糖和皂苷對氧自由基清除作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2007，2(5):100－2.

［19］Chen J，Huang Y H ，Wang N P，et al.Scavenging action of yulangsan polysaccharide and total saponinson oxygen free radicals［J］.Pharmacol Clin Chin Mat Med，2007，2(5):100－2.