姜辣素對順鉑致大鼠異嗜模型行為的作用

王茂龍，楊玉玲，魏朝霞，岳 旺，徐萬群

(青島大學醫學院附屬醫院1.胸外科、2.感染科，山東 青 島 266003;3.青島大學醫學院藥理學教研室，山東青島 266021;4.青島大學醫學院附屬醫院急診內科，山東 青 島 266003)

嘔吐是機體的保護性反射，可由多種因素誘發，腫瘤化療是最常見的原因之一，高致吐性化療藥順鉑是良好的動物模型致吐劑。人類嘔吐化學感受器觸發區(chemoreceptor trigger zone，CTZ)位于延髓背面極后區(the area postrema，AP)內，與迷走神經背核鄰近，順鉑刺激后5-HT、P物質等經血液循環至AP區可以刺激CTZ引起嘔吐。大鼠雖無嘔吐反射，但延髓亦具有AP區，其作用與CTZ相似，使用順鉑后，5-HT、P物質等化學物質作用于CTA，可以產生條件味覺厭惡(conditioned taste aversion，CTA)反應，使大鼠產生異嗜高嶺土的行為，其異嗜高嶺土的程度可間接反映嘔吐的程度［1］。

生姜作為傳統中藥已有一千多年的歷史，有“止嘔圣藥”之美譽，姜辣素(gingerol)是生姜提取物之一，其主要成分有［2］-、［4］-、［6］-姜酚和姜烯酚［2－3］等，止吐效果已得到廣泛研究。地塞米松有良好的止吐作用，可聯合5-HT3受體阻滯劑及NK1受體阻滯劑應用［4］，但其具體作用機制尚不清楚。

本研究觀察姜辣素抑制順鉑所致的大鼠異嗜高嶺土行為，并觀察大鼠AP區神經元和回腸末端神經節c-fos蛋白的表達。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 姜辣素(寶雞宏遠生物制藥，批號2005071223)溶于質量分數為1%的西黃耆膠;順鉑(齊魯制藥，批號903005CE)溶于50℃溫生理鹽水;鹽酸昂丹斯瓊注射液(奧賽康制藥，批號090102);阿瑞吡坦(Chemvon生物制藥，批號CV2910A006095)溶于質量分數為1%的西黃耆膠;磷酸地塞米松鈉注射液(魯抗制藥，批號090717302);兔抗c-fos試劑盒(北京博奧森生物bs0469R)。

1.2 動物試驗 健康♂成年Wistar大鼠［華中科技大學實驗動物中心，SCXK(鄂)2004-0007］36只，體質量200～250 g，室溫(22±2)℃，單籠飼養，12 h明暗周期(18:00～6:00為暗周期)。隨機分成6組:空白組、模型組、昂丹司瓊+地塞米松組、阿瑞吡坦+地塞米松組、姜辣素組及姜辣素+地塞米松組。順鉑(3 mg·kg－1)腹腔注射(ip)造模，并于順鉑注射前1 h及注射后24 h、48 h各組分別給予以下處理:生理鹽水(10 mg·kg－1，ig)、西黃芪膠(10 ml·kg－1，ig)、昂丹司瓊(4 mg·kg－1，ip)+ 地塞米松(5 mg·kg－1，ip)、阿瑞吡坦(8 mg·kg－1，ig)+ 地塞米松(5 mg·kg－1，ip)、姜辣素(400 mg·kg－1ig)、姜辣素(400 mg·kg－1，ig)+ 地塞米松(5 mg·kg－1，ip);觀察順鉑注射后0～24 h、48 ～72 h各組大鼠攝食量和啃食高嶺土量。72 h后處死大鼠，取AP區及回腸末端(距回盲瓣約20 cm)組織于4%的甲醛4℃固定。

1.3 免疫組化和圖像分析 將組織石蠟包埋，切片，嚴格按照抗c-fos免疫組化試劑盒說明操作。常規漂洗，抗體封閉，加1∶200稀釋的兔c-fos多克隆抗體，漂洗后加生物素化二抗，顯色，復染，脫水，透明，中性樹膠封片。200倍光鏡下隨機選取5個視野并照相，觀察外周回腸及AP區組織陽性產物的染色情況。黃光源下為淺黃色背景，標記陽性顆粒在細胞質表達，呈棕黃色或棕褐色。用奧林巴斯圖像分析系統計算陽性細胞灰度值(0代表強陽性，255代表陰性)。

2 結果

2.1 嗜高嶺土量 分別記錄0～24 h、48～72 h各組大鼠啃食高嶺土量。兩個時間段內，模型組啃食高嶺土量明顯高于正常組(P＜0.01)。0～24 h，各治療組啃食高嶺土量低于模型組(P＜0.05)。姜辣素組及姜辣素+地塞米松組啃食高嶺土量與昂丹斯瓊+地塞米松組相比差異無顯著性。48～72 h，阿瑞吡坦+地塞米松組、姜辣素組、姜辣素+地塞米松組與模型組相比均減少(P＜0.05)。姜辣素組、姜辣素+地塞米松組啃食高嶺土量低于阿瑞吡坦+地塞米松組(P＜0.05)，兩個時間段內，姜辣素組與姜辣素+地塞米松組啃食高嶺土量差異無顯著性。

2.2 攝食量 分別記錄0～24 h、48～72 h各組大鼠攝食量。兩個時間段內，模型組與正常組相比攝食量減少(P＜0.01)。0～24 h，姜辣素組進食量高于昂丹司瓊+地塞米松組和模型組(P＜0.05)，姜辣素+地塞米松組進食量高于模型組(P＜0.05)，與昂丹司瓊+地塞米松組比較無差異;姜辣素組進食量高于姜辣素+地塞米松組(P＜0.05)。48～72 h，姜辣素組攝食量高于模型組和阿瑞吡坦+地塞米松組(P＜0.05)。姜辣素+地塞米松組與模型組比較差異無顯著性。

Tab 1 The kaolin and food ingestion and c-fos immunoexpression of rats in every group

2.3 c-fos表達 c-fos陽性顆粒在回腸末端組織表達于肌間神經節(Fig 1)，在AP區表達于神經元(Fig 2)。模型組陽性顆粒灰度值低于正常組(P＜0.01)。與模型組相比，其余4組陽性顆?；叶戎稻黾?P＜0.05)。昂丹司瓊+地塞米松組、姜辣素組灰度值均低于阿瑞吡坦+地塞米松組(P＜0.05)，姜辣素+地塞米松組灰度值與阿瑞吡坦+地塞米松組比較差異無顯著性。姜辣素組灰度值低于姜辣素+地塞米松組(P＜0.05)。

Fig 1 Immunoexpression for c-fos in the ileum of rats in every group(HE×200)

3 討論

化療誘發的惡心嘔吐反應(chemotherapy-induced nausea and vomiting，CINV)按發生時間不同可分為預期性、急性和遲發性三大類［5］。急性惡心嘔吐(acute CINV)發生于化療開始后24 h內，即本實驗的第0～24 h期。研究表明，神經遞質5-HT及其受體-3在急性CINV期起主要作用［7］，臨床常用選擇性5-HT3受體拮抗劑(昂丹斯瓊等)對急性期CINV有良好治療作用［8］。本實驗選用昂丹斯瓊聯合地塞米松作為陽性藥物對照，比較了姜辣素及其聯用地塞米松在急性CINV期的抗嘔吐效果。遲發性CINV一般發生于化療后24～48 h后，有時可持續長達1周，相當于本實驗的48～72 h時期。上世紀90年代開始發現神經激肽P物質及其受體NK1在遲發CINV中具有重要作用［9］，本實驗選用選擇性NK1受體拮抗劑阿瑞吡坦聯合地塞米松作為另一陽性藥物對照，比較姜辣素及其聯用地塞米松在遲發性CINV期的抗嘔吐效果。

A:The immunoexpression for c-fos in the AP of the blank control group was light;B:The immunoexpression for c-fos was significant in model group;C:The change of immunoexpression for c-fos in Ondansetron+D group was significant compared with blank control group;D:The change of immunoexpression for c-fos in aprepitant+D group was not significant compared with blank control group;E:The changes of immunoexpression for c-fos in gingerol and gingerol+D groups were similar compared with aprepitan+D group and blank control group.

多項動物實驗結果表明生姜可抑制順鉑所致惡心嘔吐［10－11］，亦有臨床研究證實生姜可有效改善順鉑化療患者的惡心嘔吐情況［12］。生姜抗嘔吐作用主要有效成分為姜辣素，是［6］-、［8］-、［10］-姜酚(gingerol)和［6］-、［8］-、［10］-姜烯酚(shogaol)等的混合物［2－3］，其作用機制最初認為是可阻斷 5-HT3受體［13］，后證實其抑制5-HT3受體的功能并非與5-HT3受體競爭性結合，而是作用于一個調節性位點，此位點可調節P物質受體和膽堿能受體表達［14］，也有研究證實姜辣素可作用于辣椒素受體(VR1)［15］，因此，姜辣素通過作用于多種受體發揮抗嘔吐作用。本研究顯示在0～24 h內，姜辣素、姜辣素+地塞米松組啃食高嶺土量與昂丹斯瓊+地塞米松組相比差異無顯著性，即無論是否聯用地塞米松，姜辣素與昂丹斯瓊聯用地塞米松抗嘔吐效果相當，先前實驗亦證明姜辣素可通過下調5-HT表達抑制急性期CINV［16］。阿瑞吡坦+地塞米松組啃食高嶺土量多于昂丹斯瓊+姜辣素組，因阿瑞吡坦為選擇性NK1受體拮抗劑，對主要由5-HT引起的急性期CINV作用較弱，故美國臨床腫瘤學會(ASCO)腫瘤化療抗嘔吐指南中指出，阿瑞吡坦需與5-HT3受體拮抗劑聯合應用以增強其抗嘔吐效果［4］。姜辣素聯用地塞米松與單用姜辣素相比食高嶺土量差異無顯著性，說明地塞米松對姜辣素治療急性嘔吐無輔助作用。在48～72 h內，姜辣素組、姜辣素+地塞米松組與阿瑞吡坦+地塞米松組相比食高嶺土量減少，即姜辣素抗嘔吐效果優于阿瑞吡坦+地塞米松，其原因可能是阿瑞吡坦是單一NK1受體拮抗劑，而姜辣素可通過作用于多種介質及受體聯合發揮抗嘔吐作用［8］。姜辣素組與姜辣素+地塞米松組食高嶺土量差異無統計學意義，提示地塞米松對姜辣素治療遲發性嘔吐也無輔助作用。

生姜被證實可逆轉順鉑引起的胃排空障礙［17］，增加胃動力［18］，促進食欲［19］。本研究中姜辣素組大鼠進食量較模型組增加，說明姜辣素作為生姜的有效止吐成分，可促進大鼠進食。也有學者認為生姜對胃動力的促進作用是其止吐機制之一［20］。姜辣素+地塞米松組24 h內比模型組攝食量增加，但48～72 h期間，該組大鼠攝食量與模型組差異無顯著性，其原因尚不清楚。

c-fos存在于中樞和外周神經系統，中樞神經細胞受刺激后，引起 c-fos、c-jun轉錄，翻譯成 fos、jun等磷蛋白，形成同源或異源二聚體激活蛋白-1(AP-1)，調節靶基因編碼，進而導致CNS形態、結構和功能長時程的改變［21］。研究發現，給哺乳動物注射催吐藥物后可引起腦內 c-fos蛋白表達增加［22－23］，給予5-HT3受體拮抗劑預處理可使急性期c-fos表達減少［24］，說明c-fos表達可以從組織學角度反映嘔吐行為的嚴重程度。本實驗通過測定延遲期c-fos的表達，進一步證實姜辣素在延遲期抑制大鼠異嗜行為的效果。順鉑注射后大鼠AP區神經元及回腸末端肌間神經節c-fos表達均增加。治療組c-fos表達較模型組均減少，其中阿瑞吡坦+地塞米松組、姜辣素組、姜辣素+地塞米松組c-fos表達均少于昂丹斯瓊+地塞米松組，說明阿瑞吡坦及姜辣素抑制延遲性嘔吐的作用強于昂丹斯瓊。姜辣素聯用地塞米松后c-fos表達少于單用姜辣素組，此結果與兩組大鼠食高嶺土量結果有差異，原因尚需進一步研究。

綜上所述，姜辣素是從天然食用品生姜中提取的有效成分，毒副作用小，無須與地塞米松聯合應用，即對類似于人類嘔吐的大鼠異嗜模型急性期及延遲期均有抑制作用，并可以促進大鼠攝食，有利于改善營養狀況，是一種具有臨床實用價值的新型止吐藥物。

［1］Takeda N，Hasegawa S，Morita M，et al.Pica in rats is analogous to emesis:an animal model in emesis research［J］.Pharmacol Biochem Behav，1993，45(4):817－21.

［2］Kawai T，Kinoshita K，Koyama K，et al.Anti-emetic principles of Magnolia obavata bark and Zingiber officinale rhizome［J］.Planta Med，1994，60:17－20.

［3］Yang Y，Kinoshita K，Koyama K，et al.Structure-antiemetic activity of some diarylheptanoids and their analogues［J］.Phytomedicine，2002，9:146－52.

［4］Kris M G，Hesketh P J，Somerfield M R，et al.American society of clinical oncology guideline for antiemetics in oncology:Update 2006［J］.J Clin Oncol，2006，24(18):2932－47.

［5］Licitra L，Spinazzw S，Roila F.Antiemetic therapy［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2002，43(1):93－101.

［6］趙忠斌，魏振平，芮 偉.化療止吐臨床治療藥物新進展［J］.

世界臨床藥物，2006，27(8):480－4.

［6］Zhao Z B，Wei Z P，Rui W.The research of clinical anti-emetic medicines［J］.World Clin Drugs，2006，27(8):480－4.

［7］Endo T，Minami M，Hirafuji M，et al.Neurochemistry and neuropharmacology of emesis-the role of serotonin［J］.Toxicology，2000，153:189－201.

［8］Kris M G，Hesketh P J，Herrstedt J，et al.Consensus proposals for the prevention of acute and delayed vomiting and nausea following high-emetic-risk chemotherapy［J］.Support Care Cancer，2005，13:85－96.

［9］Kris M G，Roila F，DeMulder P H，et al.Delayed emesis following anticancer chemotherapy［J］.Support Care Cancer，1998，6(3):228－32.

［10］Frisch C，Hasenohrl R U，Mattern C M，et al.Blockage of lithium chloride-induced conditioned place aversion as atest for antiemetic agents:comparison of metoclopramide with combined extracts of Zingiber officinale and Ginkgo biloba［J］.Pharmacol Biochem Behav，1995，52:321－7.

［11］Sharma S S，Kochupillai V，Gupta S K，et al.Antiemetic efficacy of ginger(Zingiber officinale)against cisplatin-induced emesis in dogs［J］.J Ethnopharmacol，1997，57:93－6.

［12］Hickok J T，Roscoe J A，Morrow G R，et al.A phase Ⅱ/Ⅲ randomized，placebo-controlled，double-blind clinical trial of ginger(Zingiber officinale)for nausea caused by chemotherapy for cancer:a currently accruing URCC CCOP cancer control study［J］.Suppportive Cancer Therapy，2007，4(4):247－50.

［13］Yamahara J，Huang Q R，Iwamoto U，et al.Active components of ginger exhibiting antiserotonergic action［J］.Phytother Res，1989，3:70－1.

［14］Abdil-Aziz H，Windeck T，Ploch M，et al.Mode of action of gingerols and shogaols on 5-HT3receptors:binding studies，cation uptake by the receptor channel and contraction of isolated guineapig ileum［J］.Eur J Pharmacol，2006，530:136－43.

［15］Borrelli F，Capasso R，Pinto A，et al.Inhibitory effect of ginger(Zingiber officinale)on rat ileal motilityin vitro［J］.Life Sci，2004，74:2889－96.

［16］Qian Q H，Yue W，Wang Y X，et al.Gingerol inhibits cisplatininduced vomiting by down regulating 5-Hydroxytryptamine，Dopamine and Substance P expression in Minks［J］.Arch Pharm Res，2009，32(4):565－73.

［17］Sharma S S，Gupta Y K.Reversal of cisplatin-induced delay in gadstric emptying in rats by ginger(Zingiber officinale)［J］.J Ethnopharmacol，1998，62:49－55.

［18］Wu K L，Rayner C K，Chuah S K，et al.Effects of ginger on gastric emptying and motility in healthy humans［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol，2008，20:436－40.

［19］Wadikar D D，Nanjappa C，Premavalli K S，et al.Development of ginger based ready-to-eat appetizers by response surface methodology［J］.Appetite，2010，55:76－83.

［20］Stewart J J，Wood M J，Wood C D，et al.Effects of ginger on motion sickness susceptibility and gastric function［J］.Pharmacology，1991，42:111－20.

［21］程記偉，白 宇.即刻早期基因c-fos與癲癇關系的研究進展［J］.現代醫藥衛生，2008，24(2):221－2.

［21］Chen J W，Bai Y.The relationship of c-fos and epilepsy［J］.Mod Med Health，2008，24(2):221－2.

［22］Miller A D，Ruggiero D A.Emeti reflex are revealed by epression of ther immediate-early gene c-fos in the cat［J］.J Neurousc，1994，14(2):871－88.

［23］Billig I，Yates B J，Rinaman L.Plasma hormone levels and central c-fos expression in ferrets after systemic administration of cholecystokinin［J］.Am J Physiol，2001，281(4):1243－55.

［24］Endo T，Minami M，Nakayasu M，et al.Effects of granisetron and vagotomy on c-fos mRNA expression in the rat medulla oblongata as assessed by in situ hybridization［J］.Biomed Res，2004，25:229－35.