左卡尼汀對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌肥厚的保護作用及機制研究

姚秀云，楊育紅，宋 瑩，王洪新，張 晶，李洪秀

(1.遼寧醫學院藥理學教研室，遼寧 錦州 121000;2.遼寧省盤錦市第二醫院，遼寧 盤 錦 124000)

心肌肥厚(myocardial hypertrophy，MH)是心血管疾病患者發病率和死亡率增加的一個重要原因，心肌肥厚最終發展成心衰。左卡尼汀(L-carnitine)又稱左旋肉堿，是哺乳動物能量代謝必需的體內天然物質，對細胞中能量的產生和轉運起重要作用。L-carnitine能促進脂肪酸經β-氧化進人三羧酸循環，產生能量，與機體的器官、組織代謝密切相關［1］。L-carnitine的缺乏會導致能量供應障礙及脂肪酸代謝的各種中間產物累積酸中毒，出現心肌病變、心律失常、機體疲勞等癥狀［2］。一般認為在缺血、缺氧時，心肌細胞內脂肪酸β-氧化障礙，脂肪酸堆積，葡萄糖酵解增強，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)水平下降，線粒體膜結構改變，線粒體膜相崩解而導致細胞死亡。另有研究表明L-carnitine通過線粒體外膜上的卡尼丁脂酰轉移酶I和內膜內側的卡尼丁脂酰轉移酶Ⅱ作用，促使脂肪酸進一步分解。L-carnitine能調節乙酰輔酶A/脂酰輔酶A的比值，從而激活丙酮酸脫氫酶復合體的活性，促進葡萄糖的代謝［3］。臨床應用L-carnitine輔助治療冠心病、心絞痛、心肌梗死合并心源性休克均具有一定療效，但是應用L-carnitine在心肌肥厚及能量代謝方面的研究尚未見報道。因此本實驗采用異丙腎上腺素(Isoproterenol，Iso)誘導的大鼠心肌肥厚模型，觀察L-carnitine對心肌肥厚及反映線粒體功能的線粒體膜電位的影響，初步探討L-carnitine改善心肌肥厚后在能量代謝方面的相關機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、主要儀器與試劑 L-carnitine:沈陽東宇精細化工廠，批號:101101，純度98%。乳酸LAC測定試劑盒、游離脂肪酸FFA測定試劑盒、總蛋白測定試劑盒(考馬斯亮藍法)、羥脯氨酸測定試劑盒:南京建成生物工程研究所。線粒體膜電位Jc-1試劑盒:江蘇碧云天生物技術研究所。激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica sp5，德國Leica)

1.2 實驗動物、模型制備及分組 清潔級，SD大鼠，♀♂各半40只，體質量180～200 g，由遼寧醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(遼)2003-0007。

大鼠隨機分為4組，每組♀♂各5只。① Iso組:按Rona等［4］方法略作修改，皮下注射(sc)Iso，以20、10 和 5 mg·kg－1·d－1劑量遞減 3 d，再以 3 mg·kg－1·d－1連續 7 d，每天腹腔注射蒸餾水 2 ml·kg－1;②空白組:以等量生理鹽水代替Iso處理，并以等量蒸餾水腹腔注射;③ L-carnitine組:sc Iso同時給予 L-carnitine，按 100 mg·kg－1劑量腹腔注射每天1次;④ Propranolol組:sc Iso同時給Propranolol，按50 mg·kg－1劑量腹腔注射每天1次。各組均持續8周，標準飲食飲水。術后正常飲食，定期觀察生長狀態。

1.3 測定心肌肥厚的指數 麻醉開胸，取心臟，稱全心濕重(heart wet weight，HW)及左心室濕重(left ventricle wet weight，LVW)，計算心臟質量指數(heart mass index，HMI=HW/BW，mg·kg－1)和左室質量指數(left ventricular mass index，LVMI=LWH/BW，mg·g－1)。

1.4 測定心臟血流動力學指標 4組大鼠于停藥24 h后稱體重(body weight，BW)，腹腔注射20%烏拉坦(5 ml·kg－1·d－1)麻醉。于頸部偏右側開縱行切口，分離右頸總動脈，經右頸總動脈插入聚乙烯導管，用Pclab生物信號采集處理系統，導管插入3～3.5 cm即可進入左心室，穩定5 min后測定大鼠心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)及左室壓力變化最大速率(±dp/dtmax)。

1.5 Masson染色檢查心肌組織改變 取心尖組織迅速固定于10%甲醛中，常規石蠟包埋，制備石蠟切片，石蠟橫斷面連續切片5～6片，厚度約5 μm。切片常規脫蠟脫水，行Masson染色，光鏡下做常規觀察。

1.6 測定心肌生化指標 取心尖組織100 mg，置入含0.9%生理鹽水0.9 ml的試管中，用勻漿器勻漿，得到組織勻漿。按試劑盒方法考馬斯亮藍法測定心肌總蛋白，測定心肌羥脯氨酸(hydroxyproline，Hpy)游離脂肪酸(free fatty acids，FFA)、乳酸(lactic acid，LAC)含量。

1.7 心肌細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的測定 按照文獻［5－6］的方法制備肥厚心肌的單個心室肌細胞，取(1～6)×105細胞，重懸于 0.5 ml KB 液(mmol·L－1:L-谷氨酸70，牛磺酸 20，KCl 40，EGTA 0.5，KH2PO420，MgCl23，D-glucose 10，HEPES 10，KOH 70)中保存。加入JC-1染色工作液，細胞培養箱中37℃孵育20 min。用JC-1染色緩沖液洗滌2次，再用適量JC-1染色緩沖液重懸。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體，可以產生綠色熒光。激光共聚焦顯微鏡檢測JC-1單體時把激發光設置為490 nm，發射光設置為530 nm得到紅色熒光圖像;檢測JC-1聚合物時，把激發光設置為525 nm，發射光設置為590 nm觀察得到綠色熒光圖像，此兩通道重疊得到橘色圖像，并測得熒光強度。隨機選擇20個視野，每個視野約測4個細胞。通過對紅色和綠色熒光強度的比值計算出MMP的相對數值。

2 結果

2.1 L-carnitine對心肌肥厚大鼠心臟指數的影響

Iso連續注射10 d可引起大鼠HMI和LVMI兩指數增加50.2%和63.1%;L-carnitine和普萘洛爾能降低注射Iso后大鼠的HMI和LVMI，P＜0.01，而與空白組比較，差異無顯著性(見Fig 1)。

Fig 1 Effect of L-carnitine on heart mass index(HMI)and left ventricular mass index(LVMI)in myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats(±s，n=8)

2.2 L-carnitine對心肌肥厚大鼠血流動力學的影響 Iso連續注射10 d可引起大鼠－dp/dtmax和LVEDP高于空白組36%和50%，+dp/dtmax和LVSP也有所增加;L-carnitine和Propranolol能改善注射Iso后大鼠工作心臟的－dp/dtmax和LVEDP，分別降低了33.8%和21.4%(P＜0.01)(Tab 1)。

2.3 L-carnitine處理后心肌組織病理學觀察 大體觀察見Iso組大鼠心臟體積較空白組明顯增大，L-carnitine組和propranolol組大鼠心臟增大不明顯。光鏡下，空白組(A)心肌細胞未見明顯肥大及壞死，無膠原纖維增生;Iso組(B)見心肌細胞變大，有灶性壞死，大量膠原纖維增生呈大斑片狀，病理改變多位于心尖部心內膜下層;L-carnitine組(C)和prop-ranolol組(D)可見心肌細胞肥大程度較Iso組減輕，心肌纖維排列整齊，偶有點片狀壞死，膠原纖維增生較少(Fig 2)。

Tab 1 Effects of L-carnitine on hemodynamic parameters in myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats(±s，n=8)

Tab 1 Effects of L-carnitine on hemodynamic parameters in myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs Iso group

Group LVSP/kPa LVEDP/kPa+dp/dtmax/kPa·s－1－dp/dtmax/kPa·s －1 Control 13.9 ±1.1 5.5 ±0.9 1056 ±46 985 ±70 Iso 16.3±1.5＊＊ 8.4±1.3＊＊ 751±61＊＊ 628±57＊＊L-carnitine 15.2 ±0.9# 6.6 ±0.5## 862 ±75# 840 ±69##Propranolol14.9 ±0.9## 6.5 ±0.5## 891 ±81## 866 ±90##

Fig 2 Effect of L-carnitine on myocardial tissue pathogenic changes of myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats

2.4 L-carnitine對大鼠左心室肌組織LD和FFA含量和Hpy的影響 Iso組HPY、LAC和FFA含量高于空白組53.7%、23.1%和30.2%，L-carnitine和Propranolol能降低注射Iso后大鼠的這3項指標，各自降低了15.8%、14.5%和16.9%，但 L-carnitine組在Hpy上與空白組還是有差異，propranolol組在FFA上與空白組有差異。表明L-carnitine可以降低心肌的Hpy含量，防止膠原沉積;降低心肌FFA和LAC含量，防止其在細胞中的堆積(Tab 2)。

2.5 L-carnitine對心肌細胞線粒體膜電位影響通過對紅色和綠色熒光強度的比值計算出線粒體膜電位的相對數值。與空白組比較，Iso組MMP降低了37.3%，差異具有統計學意義(P＜0.01)。L-carnitine和propranolol組與Iso組相比MMP增高，差異有顯著性。表明L-carnitine可以在一定程度上起到保護心肌線粒體的作用(Fig 3，4)。

Tab 2 Effects of L-carnitine on contents of hydroxyproline(Hpy)，lactic acid(LAC)and free fatty acids(FFA)in myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats(±s，n=8)

Tab 2 Effects of L-carnitine on contents of hydroxyproline(Hpy)，lactic acid(LAC)and free fatty acids(FFA)in myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs Iso group

Group Hpy/μg·g－1Pro LAC/mmol·g－1Pro FFA/μmol·g－1Pro Control 0.41 ±0.039 0.39 ±0.036 195.87 ±24.71 Iso 0.63 ±0.028＊＊ 0.48 ±0.084＊＊ 254.26 ±25.11＊＊L-carnitine 0.53 ±0.031## 0.41 ±0.035## 211.53 ±22.65##Propranolol 0.48 ±0.021＊＊ 0.46 ±0.015＊＊ 244.16 ±40.90＊＊

3 討論

目前，MH已被公認為是猝死、心力衰竭等心血管事件強有力的獨立危險因素，因此，探索用于防治該病的藥物對與臨床用藥有重要的指導意義。Iso是一種人工合成的兒茶酚胺，連續皮下注射Iso可以起MH，操作簡單易于掌握，這一模型已被廣泛使用［7］。本次試驗在此模型基礎上用L-carnitine干預治療，普萘洛爾為對照，目的在于觀察L-carnitine對Iso所致大鼠MH的保護作用。結果顯示:L-carnitine有改善心功能、降低重量指數、抗心肌細胞肥大的作用。Iso組在心臟重量指數、羥脯氨酸含量指標中都較空白組有明顯增加，說明連續注射Iso確實可引起大鼠MH并伴有纖維化，對心肌組織切片的鏡下觀察也可以充分證實這一點。而MH伴纖維化也正是該組大鼠心臟舒張功能下降的直接原因。L-carnitine能改善Iso所引起的心臟重量指數增加和Hpy含量的增高，外部表現即為心功能的恢復。

有人認為L-carnitine心肌保護作用的可能機制是減少心肌對 ATP儲備的消耗，拮抗脂質過氧化［8］，從而在能量代謝、細胞保護、血管新生等多環節發揮作用。臨床觀察應用L-carnitine輔助治療患者冠心病、心絞痛、心肌梗死合并心源性休克的療效觀察，均發現L-carnitine組心功能明顯改善，治療組療效明顯優于對照組［9］。L-carnitine在大鼠缺血/再灌注中具有抗心律失常的作用且該作用可被肉堿脂酰轉移酶I(CPTI)抑制劑依托莫司(etomoxir)拮抗。提示我們L-carnitine的作用可能與促進線粒體對脂肪酸的氧化有關［10］。本次試驗的結果就 L-carnitine對Iso引起MH大鼠心肌組織中的FFA和LAC增多都有很好的調節作用，使FFA和LAC減少。這些變化心肌肥厚的能量代謝機制直接相關，同時也不能排除其對線粒體保護所產生的作用。線粒體膜電位(MMP)是反映線粒體功能的重要生物能量學參數［11－12］，控制線粒體呼吸率、ATP和ROS`生成，其電位值大小可以直接反映線粒體功能的變化。Iso組的線粒體膜電位明顯降低，L-carnitine明顯提高線粒體膜電位，對線粒體的具有保護作用，又在心肌肥厚能量代謝的另一方面起到了調節作用。

Fig 3 Effects of L-carnitine on mitochondrial membrane potential(MMP)of hypertrophic cardiomyocytes induced by Iso in rats

綜上所述，L-carnitine可以通過對肥厚心肌細胞能量代謝的調節，起到改善Iso致大鼠心肌肥厚的作用，為臨床防治心肌肥厚提供新的思路。然而L-carnitine是如何作用達到保護線粒體的，其具體機制有待進一步實驗探討。

Fig 4 Quantitative results of JC-1 fluorescence as a marker for membrane potential changes(±s，n=5)

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