細(xì)梗香草總皂苷的抗腫瘤活性研究

徐 燕，榮語(yǔ)媚，劉小保，應(yīng)弘梅，鄒莉波，田景奎

(1.浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與儀器學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系，浙江杭州 310027;2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng) 110016)

細(xì)梗香草(Lysimachia capillipesHemsl)又名滿山香、香排草，為報(bào)春花科珍珠菜屬植物。細(xì)梗香草總皂苷為本實(shí)驗(yàn)室從細(xì)梗香草全草提取的含有10余種結(jié)構(gòu)已明確的齊墩果烷型三萜皂苷［1］混合物，皂苷含量占總提物含量60%以上，其中又以細(xì)梗香草皂苷B和C這兩個(gè)新化合物為主，其含量占總皂苷 70%以上［2］。

民間將細(xì)梗香草用于治療感冒咳嗽、風(fēng)濕痹痛、抗腫瘤、月經(jīng)不調(diào)、神經(jīng)衰弱、驅(qū)蛔等［3］。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果表明細(xì)梗香草皂苷有很強(qiáng)體外抗腫瘤活性，本文重點(diǎn)研究細(xì)梗香草總皂苷的體內(nèi)抗腫瘤活性和對(duì)荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康♂C57BL/6小鼠60只，5～6周，清潔級(jí);健康BALB/c裸小鼠，5～6周，SPF級(jí)，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［SCXK(滬)2007-0005］。

1.2 細(xì)胞株 前列腺癌RM-1細(xì)胞、前列腺癌PC-3細(xì)胞、胃癌BGC-823細(xì)胞、卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞，中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.3 藥品與試劑 細(xì)梗香草總皂苷(capilliposide，LC)由本實(shí)驗(yàn)室提取，批號(hào):TS101021，總皂苷含量為63.03%。HyClone改良型RPMI 1640培養(yǎng)液，賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司;F-12培養(yǎng)液、DMEM高糖培養(yǎng)液、McCOY’S 5A培養(yǎng)液、0.25%Trypsin－0.02%EDTA，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;無(wú)支原體胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司;環(huán)磷酰胺、多西他賽注射液，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;刀豆蛋白Ⅳ(Con A typeⅣ)，杭州昊天生物技術(shù)有限公司;兔抗人VEGF多克隆一抗，thermo fisher;鏈霉親和素－過(guò)氧化物酶(SABC)、聚合HRP標(biāo)記抗兔IGg及DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物技術(shù)有限公司。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 儀器設(shè)備 HEPA class 100二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó));18#髂骨穿刺針，上海埃斯埃醫(yī)械塑料制品有限公司;數(shù)顯游標(biāo)卡尺(Mahr，德國(guó));AG 22331臺(tái)式低速離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))。

1.5 細(xì)梗香草總皂苷對(duì)小鼠前列腺癌的體內(nèi)抑瘤作用及對(duì)免疫功能影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RM-1細(xì)胞，用全血清RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×109·L－1，無(wú)菌下每只小鼠皮下接種0.2 ml。接種后 24 h，按體重隨機(jī)分為:LC 90、60、40 mg·kg－1組、陽(yáng)性對(duì)照環(huán)磷酰胺 (cyclophosphamide，CTX)30 mg·kg－1組和模型對(duì)照組(model group，M)，另設(shè)正常對(duì)照組(control group，C)，每組10只動(dòng)物。LC各給藥組連續(xù)灌胃(ig)給藥10 d，CTX隔天腹腔注射(ip)，給藥容積均為20 ml·kg－1。

1.5.1 細(xì)梗香草總皂苷對(duì)C57BL/6小鼠荷前列腺癌RM-1增殖的抑制作用 給藥期間每天監(jiān)測(cè)小鼠體重。于末次給藥24 h后處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤，計(jì)算抑瘤率(inhibitory rate，I)，計(jì)算公式如下:

I/%=(1－給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%。

1.5.2 細(xì)梗香草總皂苷對(duì)免疫功能的影響 取脾臟和胸腺，計(jì)算臟器指數(shù)(臟器指數(shù)=臟器重量/體重)。MTT法測(cè)定脾T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)［4］和IL-2活性［4］。

1.6 細(xì)梗香草總皂苷體內(nèi)抗腫瘤藥效學(xué)評(píng)價(jià) 選取前列腺癌PC-3細(xì)胞、胃癌BGC-823細(xì)胞和卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞3個(gè)敏感瘤株進(jìn)行體內(nèi)的藥效評(píng)價(jià)。

1.6.1 裸鼠荷人源腫瘤模型建立［5］取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)

期的人源腫瘤細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度為2×1010·L－1，無(wú)菌下每只小鼠皮下接種0.2 ml。組織塊接瘤法體內(nèi)傳1～2代，待腫瘤體積長(zhǎng)至100 mm3左右，隨機(jī)分組同上，陽(yáng)性對(duì)照為多西他賽(docetaxel，DTX)25 mg·kg－1組，每組6只動(dòng)物。LC隔天給藥，連續(xù)20 d左右，DTX 25 mg·kg－1每 3周尾靜脈注射給藥(iv)一次，給藥容積均為 10 ml·kg－1。

1.6.2 細(xì)梗香草總皂苷體內(nèi)抗腫瘤藥效評(píng)價(jià) 每周定期監(jiān)測(cè)腫瘤體積(tumor volume，V)，V=1/2×a×b2，其中a和b分別表示長(zhǎng)徑和短徑。計(jì)算相對(duì)腫瘤增殖率 T/C(%)=TRTV/CRTV×100%。(TRTV:治療組相對(duì)腫瘤體積;CRTV:模型組相對(duì)腫瘤體積)。末次給藥24 h后處死動(dòng)物，取瘤，并將新鮮組織用中性福爾馬林溶液固定，進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)(HE染色)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)(VEGF表達(dá))。

2 結(jié)果

2.1細(xì)梗香草總皂苷抗腫瘤藥效評(píng)價(jià)

2.1.1 細(xì)梗香草總皂苷對(duì)C57BL/6小鼠荷前列腺癌的增殖抑制作用 LC可以劑量依賴(lài)性抑制前列腺癌RM-1的生長(zhǎng)，且中、高劑量組與模型組相比差異均有顯著性，見(jiàn)Tab 1。

2.1.2 細(xì)梗香草總皂苷對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤增殖的抑制作用 LC對(duì)裸鼠胃癌BGC-823的腫瘤生長(zhǎng)曲線見(jiàn)Fig 1A，1B為腫瘤照片。結(jié)果顯示，各給藥組腫瘤體積與模型組相比均有不同程度的差異。LC對(duì)瘤裸荷前列腺癌PC-3和卵巢癌SK-OV-3的抑瘤率和末次給藥的相對(duì)腫瘤增殖率見(jiàn)Tab 2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LC可不同程度的抑制3個(gè)敏感腫瘤株的增殖，其中對(duì)前列腺癌和胃癌的抑制作用更強(qiáng)。

Fig 1 Effect of LC on tumor growth in nude mice bearing BGC-823(±s，n=6)

2.2 免疫相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)和裸鼠腫瘤組織切片染色

2.2.1 血液學(xué)指標(biāo)和免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 血液學(xué)指標(biāo)分別檢測(cè)外周血白細(xì)胞(white blood cell，WBC)、淋巴細(xì)胞(lymphocytes，LYM)、血小板(blood platelets，PLT)和血紅蛋白(hemoglobin，HGB)見(jiàn) Tab 2。與模型組小鼠相比，LC可上調(diào)荷瘤小鼠外周血液中HGB，對(duì) WBC也有一定上調(diào)作用，LYM和PLT各組未見(jiàn)差異。小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力實(shí)驗(yàn)(Fig 2A)和IL-2活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig 2B)顯示，模型組小鼠較空白組值降低;與模型對(duì)照組比較，LC中、高劑量組數(shù)值增高。

2.2.2 裸鼠荷人胃癌BGC-823腫瘤組織的病理切片分析 胃癌腫瘤組織HE染色見(jiàn)Fig3。模型組移植瘤細(xì)胞核大、深染，腫瘤細(xì)胞數(shù)量多，排列紊亂，血竇豐富，癌組織中可見(jiàn)纖維結(jié)締組織和血管增生，腫瘤的中央可見(jiàn)少量壞死區(qū)域，腫瘤細(xì)胞數(shù)量相對(duì)減少。LC各給藥組和DTX組的腫瘤細(xì)胞呈圓形或橢圓形，淡染，核分裂少見(jiàn)，腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少，可見(jiàn)較多腫瘤細(xì)胞腫脹變性壞死，甚至大片壞死［6］。

Tab 1Effect of LC on the growth of transplanted prostatic cancer(RM-1)in mice(±s)

Tab 1Effect of LC on the growth of transplanted prostatic cancer(RM-1)in mice(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group Dose/mg·kg－1 Body weight/g Beginning Ending Tumor weight/g Inhibitory rate/%Model 20.8 ±0.85 22.8 ±1.32 1.468 ±0.313 CTX 30 21.4 ±0.69 21.8 ±1.53 0.348 ±0.112＊＊ 76.3 LC 90 20.8 ±1.17 20.8 ±1.43 0.749 ±0.240＊＊ 49.0 60 20.8 ±0.98 20.6 ±1.32 0.815 ±0.514* 44.5 40 21.0 ±0.87 22.0 ±1.37 1.162 ±0.684 20.8

Tab 2 Effect of LC on tumor inhibitory rate and T/C in nude mice models(±s)

Tab 2 Effect of LC on tumor inhibitory rate and T/C in nude mice models(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group Dose/mg·kg－1 T/C/% Tumor weight/g Inhibitory rate/%PC-3 model 1.007 ±0.421 DTX 25 9.43 0.058 ±0.026＊＊ 94.3 LC 90 26.35 0.415 ±0.120＊＊ 58.8 60 40.87 0.470 ±0.090＊＊ 53.3 40 52.76 0.516 ±0.139＊＊ 48.8 SK-OV-3 model 1.250 ±0.405 DTX 25 34.06 0.368 ±0.089* 70.6 LC 90 51.70 0.553 ±0.223* 55.7 60 67.20 0.738 ±0.320 41.0 40 69.80 0.718 ±0.382 42.6

2.2.3 荷人胃癌BGC-823裸鼠腫瘤組織免疫組化染色 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig 4)顯示，LC高劑量組VEGF表達(dá)與模型組相比明顯減少，提示LC可能通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。

Tab 3Effect of LC on hematological parameters in C57BL/6 mice(±s)

Tab 3Effect of LC on hematological parameters in C57BL/6 mice(±s)

#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model.

Parameter Control Model LC 40 mg·kg－1 LC 60 mg·kg－1 LC 90 mg·kg－1CTXWBC/109·L－1 3.15 ±0.61 7.13 ±1.26## 8.34 ±1.99 8.52 ±1.78 6.78 ±1.99 4.29 ±1.55＊＊LYM/109·L －1 2.30 ±0.20 4.28 ±1.82 4.43 ±2.37 4.11 ±1.83 3.05 ±1.53 2.69 ±1.99 PLT/1011·L－1 9.25 ±1.55 8.02 ±1.63 7.44 ±3.05 4.97 ±1.46＊＊ 7.39 ±1.83 9.64 ±3.26 HGB/102g·L －1 1.48 ±0.07 1.37 ±0.09# 1.44 ±0.12 1.41 ±0.14 1.48 ±0.07*1.30 ±0.12

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中裸鼠荷瘤模型建立采用組織塊接瘤法，可以大批量一次性進(jìn)行接瘤，成瘤時(shí)間短，傳代穩(wěn)定性好，得到的模型鼠的腫瘤生長(zhǎng)更均勻。

Fig 2 (A)Effect of LC on the proliferation of spleen T lymphocyte in mice bearing RM-1;(B)Effect of LC on the activity of IL-2 in mice bearing RM-1(±s，n=8)

大量免疫學(xué)研究表明，對(duì)免疫系統(tǒng)有效的所有活性成分均對(duì)控制腫瘤生長(zhǎng)有作用。抗腫瘤免疫效應(yīng)一般以細(xì)胞免疫為主，體液免疫為輔，兩者并存且密切相關(guān)，非特異性免疫及各種細(xì)胞因子在腫瘤免疫中也起著非常重要的作用［4］。本研究主要考察了LC對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、IL-2活性的影響，并對(duì)血液學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，LC可一定程度上調(diào)外周血中WBC和HGB，可明顯提高Con A誘導(dǎo)的脾T淋巴細(xì)胞增殖(P＜0.05)和IL-2活性(P＜0.05)，說(shuō)明LC可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞對(duì)有絲分裂原的反應(yīng)性，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞功能，從而促進(jìn)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

Fig 3 Histopathology of tumor tissue in nude mice bearing BGC-823(HE×400)

Fig 4 Effect of LC on immunohistochemistry of tumor tissue in nude mice bearing BGC-823(SABC×400)

腫瘤血管的形成對(duì)直徑大于1～3 mm的實(shí)體瘤的進(jìn)一步生長(zhǎng)極其重要，腫瘤誘導(dǎo)新生血管形成的過(guò)程是一個(gè)多種正負(fù)因素共同作用的結(jié)果。至今至少已有15種腫瘤血管形成因子見(jiàn)諸報(bào)道［7］，其中，VEGF是誘導(dǎo)和促進(jìn)血管生成最強(qiáng)有力的關(guān)鍵因子，也是抗腫瘤血管生成的重要靶點(diǎn);腫瘤組織往往過(guò)量表達(dá)VEGF因子，該因子可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGF受體特異性結(jié)合，活化其細(xì)胞內(nèi)酪氨激酶，并最終促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和游走，構(gòu)成管樣結(jié)構(gòu)［8］。有研究表明，三萜皂苷可能通過(guò)RTKs以及VEGF/VEGFR信號(hào)通路抑制血管增生［9］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)腫瘤組織中VEGF的表達(dá)，研究LC對(duì)腫瘤血管生成的影響，初步探究其可能的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LC對(duì)腫瘤新生血管的生成有一定抑制作用，提示該化合物可能通過(guò)抑制腫瘤血管生成從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

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