納米活性炭吸附多烯紫杉醇對A549細胞增殖及凋亡的影響*

蔡要欣，張韌錚，孫 嵐，宋東穎，劉貴富，張莉蓉#，張英鴿#

1)軍事醫學科學院毒物藥物研究所 北京 100850 2)鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室鄭州 450001 3)吉林大學藥學院長春 130021 4)中國人民解放軍66018部隊衛生隊北京 100144

#通訊作者，張英鴿，男，1958年10月生，博士，教授，研究方向:納米藥理，E-mail:zhangyg58@126.com;張莉蓉，女，1964年10月生，博士，教授，研究方向:遺傳藥理，E-mail:lrzhang@zzu.edu.cn

納米活性炭吸附多烯紫杉醇對A549細胞增殖及凋亡的影響*

蔡要欣1，2)，張韌錚2)，孫 嵐1)，宋東穎1，3)，劉貴富4)，張莉蓉2)#，張英鴿1)#

1)軍事醫學科學院毒物藥物研究所 北京 100850 2)鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室鄭州 450001 3)吉林大學藥學院長春 130021 4)中國人民解放軍66018部隊衛生隊北京 100144

#通訊作者，張英鴿，男，1958年10月生，博士，教授，研究方向:納米藥理，E-mail:zhangyg58@126.com;張莉蓉，女，1964年10月生，博士，教授，研究方向:遺傳藥理，E-mail:lrzhang@zzu.edu.cn

納米活性炭;多烯紫杉醇;A549細胞;凋亡;增殖

目的:研究納米活性炭吸附多烯紫杉醇(ACNP-DOC)對人肺腺癌細胞A549增殖及凋亡的影響。方法:將A549細胞分別用0.2、1.0、5.0、25.0和125.0 μmol/L DOC和ACNP-DOC培養12、24、48和72 h后，MTT法測細胞增殖抑制率。將A549分別用IC50濃度的ACNP-DOC、DOC和與ACNP-DOC等量的ACNP培養24 h后，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結果:0.2～125.0 μmol/L的DOC及ACNP-DOC對A549細胞均有增殖抑制作用，作用呈濃度和時間依賴性，ACNP-DOC組細胞增殖抑制率高于DOC組(F藥物=12.326，F時間=76.247，F濃度=53.028，F交互=20.842，P＜0.05)。ACNP-DOC的IC50為0.80 μmol/L，DOC為43.45 μmol/L。ACNP、DOC和ACNP-DOC組的細胞總凋亡率差異有統計學意義(F=30.208，P＜0.001)，ACNP-DOC組凋亡率高于ACNP組和DOC組(P均＜0.001)。結論:ACNP-DOC較DOC對A549細胞有較強的增殖抑制及誘導凋亡作用。

肺癌是一種嚴重影響人類健康的疾病。近年來，多烯紫杉醇(docetaxel，DOC)已成為臨床上治療肺癌、乳癌等一些實體瘤的一線藥物，但由于DOC選擇性低、復發率高，且治療指數低、毒副作用高，患者常不能忍受化療的痛苦。有文獻報道［1］，在生物體內，與傳統藥物制劑相比，以納米活性炭(activated carbon nanoparticles，ACNP)為藥物載體的制劑表現出明顯的優勢，它所攜帶的藥物具有緩控釋作用，使游離藥物濃度長時間維持在治療窗，并可提高局部組織藥物的濃度［2-5］。作者觀察了納米活性炭吸附多烯紫杉醇(ACNP-DOC)對人肺腺癌A549細胞增殖和凋亡的影響，為其臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 高糖DMEM培養液(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，胰蛋白酶和DMSO(Amresco公司)，MTT(ACROS公司)，DOC(北京偶合科技有限公司)，ACNP、ACNP-DOC均為國家納米中心協作實驗室自制，細胞凋亡檢測試劑盒(寶賽生物技術有限公司)。A549細胞株由國家納米中心協作實驗室凍存。

1.2 細胞培養 A549細胞常規培養于含體積分數10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養基中，并于37℃、95%濕度、含體積分數5%CO2的培養箱中培養，3～4 d傳代1次，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 ACNP-DOC對A549細胞增殖影響的觀察將處于對數生長期的A549細胞，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化，加入適量新鮮含有體積分數10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養基，用吹打管吹打成單細胞懸液，調整細胞密度為1.5×105mL－1，按100 μL/孔接種于96孔板中，然后分別用0.2、1.0、5.0、25.0和125.0 μmol/L DOC和ACNP-DOC培養，每個濃度設5個復孔，每孔加藥50 μL。培養12、24、48和72 h后，MTT法測細胞增殖抑制率，檢測波長為490 nm。取復孔平均光密度(OD)值為結果，細胞增殖抑制率=(對照組OD值－實驗組OD值)/對照組OD值×100%。實驗重復5次。

1.4 ACNP-DOC對A549細胞凋亡影響的觀察將A549接種于50 mL培養瓶中，至細胞豐度約達80%時，隨機分成3組，每組2瓶，分別加入IC50濃度的ACNP-DOC、DOC和與ACNP-DOC等量的ACNP后繼續培養24 h，然后用2.5 g/L胰蛋白酶消化，經吹打、收集，調細胞密度為(0.5～1.0)×106mL－1，1 000 r/min離心10 min(4℃)，PBS(4℃)洗2次后，棄上清。細胞分別重懸于200 μL Binding Buffer和10 μL Annexin V-FITC中，室溫避光反應15 min，加入300 μL Binding Buffer，總反應體積不少于500 μL，上機前5 min加入50 μL PI避光反應后，上流式儀檢測凋亡率。實驗重復3次

1.5 統計學處理 應用SPSS 17.0進行分析，采用2×5×4析因設計的方差分析評估DOC及ACNPDOC對A549細胞增殖的影響，3組間細胞總凋亡率的比較應用單因素方差分析及LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 ACNP-DOC對A549細胞增殖的影響 經不同濃度DOC及ACNP-DOC作用不同時間后，A549細胞增殖測定結果見表1。DOC及ACNP-DOC對A549細胞均有增殖抑制作用，ACNP-DOC較DOC明顯。ACNP-DOC的IC50為0.80 μmol/L，DOC為43.45 μmol/L。

2.2 ACNP-DOC對A549細胞凋亡的影響 ACNP、DOC和 ACNP-DOC組的總凋亡率分別為(5.73±2.08)%、(12.89±1.94)%和(27.95± 3.04)%，3組間比較差異有統計學意義(F= 30.208，P＜0.001)，ACNP-DOC組凋亡率高于ACNP組和DOC組(P均＜0.001)。

表1 不同濃度DOC及ACNP-DOC作用12、24、48和72 h后A549細胞的增殖抑制率(n=5)

3 討論

DOC是新一代半合成紫杉醇類抗癌藥物，屬于細胞周期特異性藥，作用于M期，能促進微管蛋白裝配成微管和抑制微管解聚，從而導致穩定的非功能性微管束的形成，使紡錘體失去正常功能，致使癌細胞死亡，具有較高的抗腫瘤活性。然而傳統的DOC抗癌化療方法具有低選擇性、高毒性及嚴重耐藥等缺點，如果通過使用載體將DOC選擇性地輸送到肺癌組織周圍而不輸送到或很少輸送到正常組織和器官，且能較長時間在肺癌周圍保持一定的藥物濃度，將可以提高療效，并改善患者的生存質量。

由于具有蜂窩狀多孔結構，ACNP具有良好的吸附性能，但ACNP與被吸附藥物之間并沒有形成牢固的共價鍵，所以當游離藥物濃度降低時被吸附的藥物可以從ACNP介孔表面解離出來，再次變成游離的藥物。ACNP顆粒的粒徑越小，比表面積就越大，吸附能力也就越強［6-7］。故作者選用ACNP作為DOC的吸附載體。實驗中選用A549細胞作為受試細胞，因為該細胞易于培養，比較適用于納米材料的體外細胞毒性作用研究［8-10］。

實驗結果顯示，ACNP-DOC及DOC在0.2～125.0 μmol/L濃度范圍作用12、24、48和72 h后均可抑制A549細胞的增殖，并且隨著藥物濃度的增高及作用時間的延長，抑制作用也增強，抑制率與藥物濃度和作用時間之間均成量效關系;結果也顯示ACNP-DOC較DOC抑制A549細胞的增殖效果更明顯。

細胞凋亡是一種由基因控制的、主動的程序化細胞死亡過程，是維持器官組織細胞數量穩定和內環境穩定的重要機制［11］，是在基因控制下的細胞自我消亡過程;促進細胞凋亡將有助于徹底治愈腫瘤［12-13］。該研究結果顯示，ACNP-DOC和DOC均可促進A549細胞的凋亡，且ACNP-DOC的作用強于DOC。

綜上所述，ACNP-DOC較DOC對A549細胞有更強的增殖抑制及誘導凋亡作用，ACNP-DOC可能較傳統的DOC給藥方法具有更好的抗腫瘤效用。

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Effects of docetaxel-loaded activated carbon nanoparticles on proliferation and apoptosis of A549 cells

CAI Yaoxin1，2)，ZHANG Renzheng2)，SUN Lan1)，SONG Dongying1，3)，LIU Guifu4)，ZHANG Lirong2)，ZHANG Yingge1)1)Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 1008502)Department of Pharmacology，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 3)College of Pharmacy，Jilin University，Changchun 130021 4)Chinese People’s Liberation Army 66018 Military Health Team，Beijing 100144

activated carbon nanoparticle;docetaxel;A549 cell;apoptosis;proliferation

Aim:To study the effects of docetaxel(DOC)-loaded activated carbon nanoparticles(ACNP-DOC)on proliferation and apoptosis of human lung cancer A549 cells.Methods:A549 cells were teated with 0.2，1.0，5.0，25.0 and 125.0 μmol/L DOC or ACNP-DOC for 12，24，48 and 72 h，respectively，then the proliferation inhibition rate was assayed by MTT.A549 cells were teated with ACNP-DOC，DOC and ACNP at dose of IC50for 24 h，then the apoptosis rate was detected by flow cytometry.Results:DOC and ACNP-DOC in the concentration range of 0.2～125.0 μmol/L could inhibit A549 cell proliferation in a time-and concentration-dependent manner，but the effects of ACNP-DOC were significantly stronger(Fdrug=12.326，Ftime=76.247，Fdose=53.028，Finteraction=20.842，P＜0.05).IC50of ACNP-DOC and DOC was 0.80 and 43.45 μmol/L，respectively.The apoptosis rate of A549 cells treated with ACNP，DOC，or ACNP-DOC at the dose of IC50differed from each other(F=30.208，P＜0.001)，and that of ACNP-DOC group was higher than those of ACNP group and DOC group(P＜0.001).Conclusion:ACNP-DOC can inhibit A549 cell proliferation，induce apoptosis，and the effects is stronger than DOC.

R734.2

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.004

*國家863計劃項目 2006AA03Z333;國家973計劃項目 2010CD933904

(2012-02-15收稿 責任編輯王 曼)