白癜風患者外周血T淋巴細胞CD28、CTLA-4的表達*

杜軍波，于建斌，黃建敏，張江安，苗 青，張 斌，張 毅

1)鄭州大學第一附屬醫院皮膚科鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心鄭州 450052 3)鄭州大學生物工程系鄭州 450001 4)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室鄭州450052

#通訊作者，于建斌，男，1962年5月生，博士，教授，主任醫師，研究方向:皮膚腫瘤與色素性皮膚病，E-mail:yjbdoctor@sina.com;張毅，男，1964年4月生，博士，教授，研究方向:腫瘤免疫及生物治療，E-mail:chyizhang@gmail.com

白癜風患者外周血T淋巴細胞CD28、CTLA-4的表達*

杜軍波1，2)，于建斌1)#，黃建敏2)，張江安1)，苗 青1)，張 斌2)，張 毅2，3，4)#

1)鄭州大學第一附屬醫院皮膚科鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心鄭州 450052 3)鄭州大學生物工程系鄭州 450001 4)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室鄭州450052

#通訊作者，于建斌，男，1962年5月生，博士，教授，主任醫師，研究方向:皮膚腫瘤與色素性皮膚病，E-mail:yjbdoctor@sina.com;張毅，男，1964年4月生，博士，教授，研究方向:腫瘤免疫及生物治療，E-mail:chyizhang@gmail.com

白癜風;T淋巴細胞;CD28;CTLA-4

目的:檢測白癜風患者外周血T淋巴細胞CD28、CTLA-4的表達情況。方法:選擇白癜風患者20例(進展期10例，穩定期10例)和健康對照10例，密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)后，應用流式細胞儀檢測細胞表面CD28、CTLA-4的表達。結果:3組外周血CD8+T細胞CD28的表達差異無統計學意義(F=1.187，P=0.320)，但外周血CD3+和CD4+T細胞CD28和CTLA-4的表達、以及CD8+T細胞CTLA-4的表達差異均有統計學意義(F=5.132、6.963、4.927、8.751和5.219，P均＜0.05)。與對照組相比，進展期組CD3+和CD4+T細胞CD28的表達及CD8+T細胞CTLA-4的表達差異無統計學意義(P＞0.05)，而CD3+和CD4+T細胞CTLA-4的表達降低(P＜0.05);穩定期組CD3+和CD4+T細胞CTLA-4的表達與對照組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，但CD3+和CD4+T細胞CD28的表達明顯降低(P＜0.05)。結論:白癜風患者外周血T淋巴細胞上CD28、CTLA-4表達異常，可能與患者免疫功能紊亂及疾病發生發展有關。

白癜風是一種自身免疫性疾病，其發病機制至今尚不十分清楚，但T細胞介導的細胞免疫異常是研究的重點之一，而T淋巴細胞和抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)的異常活化被認為是導致免疫紊亂的基礎。共刺激分子CD28屬于免疫球蛋白超家族，在免疫調節中發揮重要作用。APC上的B7與T細胞上相應的受體CD28結合，向T細胞提供活化的第二信號(共刺激信號)，可增強T細胞的活化及增殖［1］。細胞毒T淋巴細胞相關抗原4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)是T細胞上的一種跨膜受體，與CD28共同享有B7分子配體，而CTLA-4與B7分子結合后誘導T細胞無反應性，參與免疫反應的負性調節。國內外對外周血T淋巴細胞CD28、CTLA-4的檢測多是應用于系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎以及其他自身免疫性疾病［2-4］，而針對白癜風的研究尚未見報道。因此作者對白癜風患者外周血T淋巴細胞CD28、CTLA-4的表達進行了檢測，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 20例白癜風患者均為2011年鄭州大學第一附屬醫院皮膚科門診確診病例，患者均無其他免疫系統疾病，檢測前1個月內未接受過任何免疫治療。其中男8例，女12例，年齡18～33 (28.2±8.5)歲。按照中國中西醫結合學會皮膚性病專業委員會色素病學組2003年修定的白癜風臨床分型及療效標準［5］分為進展期10例和穩定期10例。另選取同期體檢健康者10例為對照，其中男4例，女6例，年齡21～29(24.5±7.4)歲。

1.2 外周血T淋巴細胞CD28、CTLA-4的檢測

無菌條件下抽取入選對象晨起空腹外周靜脈血10 mL，肝素抗凝，密度梯度離心法分離單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，用50 mL PBS洗滌2次備用。將新分離的PBMC重懸于100 μL PBS中，分別與2 μL熒光素標記的小鼠抗人CD3、CD4、CD8、CD28、CTLA-4單抗或小鼠IgG對照球蛋白在4℃條件下避光孵育15 min，PBS洗滌2次，重懸于500 μL PBS中，上流式細胞儀檢測。FITC標記的鼠抗人CD4、CD8單抗，PE標記的鼠抗人CD3單抗，APC標記的CD28、CTLA-4單抗，以及相應的鼠抗人 IgG-PE抗體、IgG-FITC抗體、IgGAPC抗體均為美國BD公司產品。流式儀檢測時，以前向散射“開窗”于淋巴細胞，根據同型對照調節各熒光的光電倍增管電壓，顏色補償設定在允許范圍內。每份樣本收集10 000個PBMC，分析CD3、CD4、CD8、CD28、CTLA-4的表達。

1.3 統計學處理 應用SPSS 17.0進行數據處理，3組外周血T細胞CD28、CTLA-4表達水平的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

3組外周血T細胞CD28、CTLA-4的表達情況見表1、表2。

表13 組外周血T細胞CD28的表達情況 %

表23 組外周血T細胞CTLA-4的表達情況 %

3 討論

CD28與CTLA-4是一對具有正負調節功能的共刺激分子，它們的天然配體為存在于APC表面的B7分子家族。前者提供T細胞活化信號，后者提供反饋性免疫負性調節信號［6］，兩者在T細胞激活的始動階段就發揮重要作用。CD28是最早被證實的共刺激分子，它以同型二聚體的形式主要表達于CD4+和CD8+T細胞表面。CTLA-4又名CD152，也是免疫球蛋白超家族成員之一，是T細胞上的一種跨膜受體，與CD28共同享有B7分子配體。CD28與CTLA-4競爭性地與B7分子結合，發揮相應的免疫學效應。CD28與相應配體結合后，傳導第二信號，可增強T細胞的活化及增殖。T細胞激活后，CTLA-4表達迅速上調，競爭性地與APC上的B7分子結合，阻斷CD28分子作用，起到抑制或終止免疫反應的作用［7］。

白癜風作為一種自身免疫性疾病，有兩個主要的發病機制，一是T細胞介導的，一是抗體介導的［8］，其中T細胞介導的細胞免疫尤為重要。國內外研究［9-10］發現，細胞毒性T淋巴細胞介導的黑色素細胞的破壞與白癜風的發展密切相關。因此，了解T淋巴細胞表面與免疫反應相關的生物標志的表達情況，對白癜風發病機制的研究有重要意義。

研究［11］發現，晚期宮頸癌患者外周血 CD4+、CD8+T細胞上CD28的表達量低于健康對照組，而且T細胞上CTLA-4的表達明顯升高，提示晚期宮頸癌患者T細胞免疫受到的抑制與CD28及CTLA-4的表達失調密切相關。CTLA-4基因敲除小鼠出生3～4周后淋巴結體積增大為對照組的8倍，淋巴細胞數為對照組的5～10倍，骨髓、肝、肺、心臟和胰腺出現彌漫或局灶性T細胞浸潤，外周血T淋巴細胞大量增殖，說明CTLA-4在正常T淋巴細胞增殖、活化中起著重要的抑制作用，是機體維持淋巴細胞穩態的關鍵環節［12］。

該研究結果顯示，與對照組相比，白癜風患者進展期CD3+和CD4+T淋巴細胞上CD28分子的表達無明顯差異，而起負性調節作用的CTLA-4的表達則有所降低，提示在白癜風進展過程中，免疫抑制作用減弱，使得免疫反應相對亢進，導致了疾病的進一步發展。在臨床上，部分患者發生白癜風后未經免疫治療，皮損不再擴大，進入穩定期。臨床上也有很多白癜風患者的皮損呈持續發展狀態，稱為進展期。白癜風進入進展期，說明這些患者體內過激的免疫反應未得到自身的有效調節。該研究結果顯示，與進展期相比，白癜風穩定期患者T淋巴細胞上CD28分子的表達下調，表明過激的細胞免疫已經受到自身某些因素的抑制，而穩定期CTLA-4的表達與進展期相比無明顯差異，這與文獻［6］報道不一致。這種現象的出現是否只和白癜風相關，還是由其他因素所致，需要深入研究。

［1］Sharpe AH，Freeman GJ.The B7-CD28 superfamily［J］.Nat Rev Immunol，2002，2(2):116

［2］Botturi K，Lacoeuille Y，Cavaillès A，et al.Differences in allergen-induced T cell activation between allergic asthma and rhinitis:Role of CD28，ICOS and CTLA-4［J］.Respir Res，2011，12:25

［3］立彥，王自正，杜同信，等.自身免疫性疾病患者外周血T細胞CD8/CD28表達的變化及臨床意義［J］.放射免疫學雜志，2008，21(3):274

［4］張儀，韓波.CD28在疾病治療中的作用研究進展［J］.實用兒科臨床雜志，2008，23(15):1204

［5］中國中西醫結合學會皮膚性病專業委員會色素病學組.白癜風臨床分型及療效標準:2003年修定稿［J］.中國中西醫結合皮膚性病學雜志，2004，3(1):65

［6］Carreno BM，Collins M.The B7 family of ligand and its receptors:new pathways for costimulation and inhibition of immune responses［J］.Annu Rev Immunol，2002，20:29

［7］Peggs KS，Allison JP.Co-stimulatory pathways in lymphocyte regulation:the immunoglobulin superfamily［J］.Br J Haematol，2005，130(6):809

［8］Michelsen D.The Double Strike Hypothesis of the vitiligo pathomechanism:new approaches to vitiligo and melanoma［J］.Med Hypotheses，2010，74(1):67

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［11］Kosmaczewska A，Bocko D，Ciszak L，et al.Dysregulated expression of both the costimulatory CD28 and inhibitory CTLA-4 molecules in PB T cells of advanced cervical cancer patients suggests systemic immunosuppression related to disease progression［J］.Pathol Oncol Res，2012，18(2): 479

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Expressions of CD28 and CTLA-4 in peripheral blood T cells of patients with vitiligo

DU Junbo1，2)，YU Jianbin1)，HUANG Jianmin2)，ZHANG Jiang’an1)，MIAO Qing1)，ZHANG Bin2)，ZHANG Yi2，3，4)1)Department of Dermatology，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 4500522)Biotherapy Center，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052 3)Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 4)Key Disciplines Laboratory for Clinical Medicine of Henan Province，Zhengzhou 450052

vitiligo;T lymphocyte;CD28;CTLA-4

Aim:To detect the expressions of CD28 and CTLA-4 in peripheral blood T cells of patients with vitiligo.Methods:Twenty vitiligo patients including 10 cases of progressive stage and 10 cases of stationary stage，and 10 normal individuals served as controls were subjected to isolated peripheral blood mononuclear cells(PBMC)by density gradient centrifugation.The expressions of CD28 and CTLA-4 in T cells were detected using flow cytometry.Results:There were significant differences in the expressions of CD28 and CTLA-4 in CD3+T cells，CD4+T cells，and CTLA-4 in CD8+T cells among the three groups(F=5.132，6.963，4.927，8.751，and 5.219，P＜0.05)，but not in the expressions of CD28 in CD8+T cells(F=1.187，P=0.320).Compared with those of the control group，the expressions of CD28 in CD3+T cells and CD4+T cells，and CTLA-4 in CD8+T cells in progressive stage vitiligo group were not significantly different(P＞0.05)，but those of CTLA-4 in CD3+T cells and CD4+T cells were lower(P＜0.05);the expressions of CTLA-4 in CD3+T cells and CD4+T cells in stationary stage vitiligo group were not statistically different(P＞0.05)，but those of CD28 in CD3+T cells and CD4+T cells were lower(P＜0.05).Conclusion:The abnormal expressions of CD28，CTLA-4 in peripheral blood T cells in patients with vitiligo may induce functional disorders of costimulatory molecules，and may be relevant to the occurrence and development of vitiligo.

R758.4

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.009*國家自然科學基金資助項目 81171986;河南省衛生廳重大科技攻關基金資助項目 20110110001，河南省科技廳基礎與前沿技術研究基金資助項目 112300410153

(2012-03-13收稿 責任編輯王 曼)