黃芪多糖對大劑量60Co γ射線損傷大鼠睪丸間質細胞的影響*

王 瑞，張 杰，張衛星，秦俊昌，王 磊

鄭州大學第一附屬醫院泌尿外科;河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室;鄭州大學腫瘤分子外科研究所鄭州 450052 #通訊作者，男，1957年7月生，博士，教授，主任醫師，研究方向:泌尿外科、男科學，E-mail:huzi918@hotmail.com

黃芪多糖對大劑量60Co γ射線損傷大鼠睪丸間質細胞的影響*

王 瑞，張 杰，張衛星#，秦俊昌，王 磊

鄭州大學第一附屬醫院泌尿外科;河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室;鄭州大學腫瘤分子外科研究所鄭州 450052 #通訊作者，男，1957年7月生，博士，教授，主任醫師，研究方向:泌尿外科、男科學，E-mail:huzi918@hotmail.com

黃芪多糖;睪丸間質細胞;60Co γ射線;大鼠

目的:探討黃芪多糖(APS)對60Co γ射線損傷大鼠睪丸間質細胞的防治作用。方法:雄性SD大鼠30只，隨機分為空白對照組、60Co γ照射組、APS+60Co γ照射組。觀察各組大鼠睪丸間質細胞的形態學改變;ELISA法檢測血清睪酮(T)、黃體生成素(LH)的含量;RT-PCR法檢測睪丸間質細胞黃體生成素受體(LHR)mRNA水平。結果:與空白對照組相比，60Co γ照射組大鼠睪丸間質細胞形態發生改變，細胞體積縮小，胞質減少，細胞核皺縮，數目減少;APS+60Co γ照射組睪丸組織病理改變較60Co γ照射組減輕。3組大鼠血清T及LH水平差異無統計學意義(F=2.446和1.142，P＞0.05)，睪丸組織中LHR的mRNA的表達差異有統計學意義(F=24.032，P＜0.001)。結論:APS可防治60Co γ射線對睪丸間質細胞損傷，其機制可能與促進睪丸間質細胞LHR mRNA的高表達有關。

黃芪多糖(astragalus polysacharin，APS)是中藥黃芪的主要活性成分之一，具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗應激及抗氧化等作用［1-3］。有研究［4］證明60Co γ射線適當劑量照射會導致睪丸間質細胞、支持細胞損傷，從而導致生精功能障礙。作者采用60Co γ射線對SD大鼠進行一次性大劑量睪丸區域局部照射，觀察睪丸間質細胞的輻射損傷情況及APS對該損傷的防護作用，為臨床上因射線致睪丸功能受損的治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 清潔級、雄性、8周齡SD大鼠30只，體質量(180±15)g，由河南省實驗動物中心提供，合格證號scxk(豫)2005-0001。APS購自陜西森弗生物有限公司，純度95%。使用前以5 g/L羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，食品級，購自鄭州萬利來食品添加劑有限公司)按所需含量配制。60Co γ射線源(GWGP80型60Co治療機，山東新華醫療器械股份有限公司)。

1.2 實驗動物分組及建模 將大鼠隨機分為3組:空白對照組，60Co γ照射組，APS+60Co γ照射組，每組10只。前2組以生理鹽水20 mL/(kg·d)灌胃，第3組以80 mg/(kg·d)APS灌胃20 mL/(kg· d)。2周后，60Co γ照射組、APS灌胃+60Co γ照射組大鼠給予60Co γ射線8.0 Gy睪丸區局部照射517 s，源距75 cm，照射面積20 cm×20 cm。繼續灌胃1周后，禁食12 h，以體積分數10%水合氯醛4.0 mL/kg麻醉大鼠，自股動脈采血5 mL，2 000 r/min離心15 min，分離血清置－20℃保存備用。然后剖取睪丸，一部分用Bouin液固定，供組織學檢查，另一部分置－80℃冰箱保存，供黃體生成素受體(luteinizing hormone receptor，LHR)mRNA檢測。

1.3 觀察指標及方法 每只大鼠左睪丸橫切面切開，取3 mm厚睪丸組織，置于Bouin液固定，石蠟包埋，3 μm厚連續切片，HE染色，中性樹膠封固，光鏡觀察睪丸組織結構。采用ELISA法測定各組大鼠血清LH、睪酮(testosterone，T)含量，試劑盒由上海研吉生物科技公司提供。?。?0℃冰箱保存的新鮮睪丸組織約100 mg，加1 mL Trizol(上海生工生物工程有限公司)，UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取睪丸組織的總RNA;取5 μg總RNA，逆轉錄成cDNA。取1 μg cDNA為模板，在Taq聚合酶催化下行PCR擴增，參照GenBank中LHR和RPS16 mRNA序列設計引物(上海生工生物工程有限公司設計合成)，其中RPS16為內參照。優化PCR反應條件(表1)，使PCR產物位于線性擴增區。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，Quantity one凝膠分析系統進行分析，以目的基因和內參條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA的相對含量。

表1 PCR引物序列及擴增條件

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0進行分析，應用單因素方差分析比較各組血清LH、T及LHR mRNA表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組大鼠睪丸間質細胞的病理變化 空白對照組睪丸間質細胞多呈橢圓形或三角形，分布在血管周圍、曲精小管之間，細胞大，胞質豐富;細胞核呈圓形或橢圓形，核內染色質分布均勻，染色較淡(圖1A)。60Co γ照射組可見睪丸間質細胞位于精曲小管之間的間質中，呈圓形、多邊形或短梭形，較稀疏，有的甚至單個散在分布，胞質減少，細胞核皺縮，染色質濃集、深染(圖1B)。APS+60Co γ照射組睪丸間質細胞損傷現象較60Co γ照射組有所恢復，形態接近正常(圖1C)。

2.2 3組大鼠血清LH、T水平及睪丸組織中LHR mRNA的表達的比較 見表2。

表23 組大鼠血清LH、T水平及睪丸組織中LHR mRNA的表達的比較

圖13 組大鼠睪丸間質細胞形態(HE，×400)

3 討論

睪丸間質細胞又稱睪丸間隙細胞，分布于生精小管之間的間隙組織中，含量占睪丸細胞數量的2%～4%，其功能主要是分泌T，動物體內約95%左右的T是睪丸間質細胞分泌的［5］。有研究［4］證明60Co γ射線大劑量照射(單次照射劑量6.0 Gy及以上)會導致睪丸間質細胞、支持細胞及生精細胞損傷，從而使生精功能障礙。以往研究［6］證實，γ射線照射后會引發機體產生氧化應激反應，使抗氧化酶類活性降低及過氧化物的含量升高，進而對機體產生損傷。因輻射而產生的大量自由基，可攻擊生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸引起脂質的過氧化，使膜的穩定性受破壞，從而使相關蛋白合成和分泌受到影響［7］。Sivakumar等［8］亦在相關研究中得出類似結論，認為大劑量60Co γ射線輻射除降低LH信號轉導之外，還可直接影響類固醇物質的合成機制。該研究結果表明:大劑量的60Co γ射線局部照射大鼠睪丸會使睪丸間質細胞形態發生改變，并影響間質細胞表面LHR的表達。

現代藥理學研究［9-10］認為黃芪的主要活性成分是多糖類、苷類等，具有抗輻射、抗缺氧等作用。研究［11］認為APS的抗輻射作用是基于其逆轉SOD活性的降低，并能有效清除輻射產生的自由基，使MAD的含量降低，從而降低輻射損傷。該實驗中APS+60Co γ照射組大鼠睪丸病理變化受損程度均較60Co γ照射組輕微，證明APS對60Co γ射線輻射損傷睪丸間質細胞具有一定防治作用。

T的合成受下丘腦-垂體-睪丸軸的調節［12］，其中任何一個環節受損均會導致其合成障礙。理論上講，輻射后睪丸間質細胞膜上LHR受損，不能有效與LH結合，會使血中游離的LH增加及睪丸中T的合成減少，釋放入血的T也會減少，通過負反饋作用調節下丘腦-垂體-睪丸軸，使血中LH進一步升高［13］。該實驗中60Co γ照射組大鼠睪丸間質細胞LHR mRNA表達確有不同程度降低，血清T、LH雖有波動(升高或降低)，但差異卻無統計學意義，可能與照射后時間過短，體內激素水平代償平衡有關。因為睪丸間質細胞表面LHR受損，排除機體自身恢復機制，長期觀察可能會出現T水平降低，有待后續相關研究證實。

綜上所述，可以看出大劑量60Co γ射線局部照射睪丸會使睪丸間質細胞形態發生改變，并破壞其表面的LHR。APS對這種輻射損傷具有一定的防治作用，其抗輻射作用機制之一可能與清除氧自由基、抗脂質過氧化及促進睪丸間質細胞LHR mRNA的表達有關，是否有臨床應用價值，有待于進一步深入研究。

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Effects of astragalus polysacharin on rat leydig cells exposed to60Co γ ray

WANG Rui，ZHANG Jie，ZHANG Weixing，QIN Junchang，WANG LeiDepartment of Urology，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University;Open Laboratory of Key Discipline of Clinical Medical Sciences，Higher School of Henan Province;the Institute of Molecular Cancer Surgery of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

astragalus polysacharin;leydig cell;60Co γ ray;rat

Aim:To investigate the protection of astragalus polysacharin(APS)on the impairment of the leydig cells caused by higher doses of60Co γ in rats.Methods:Thirty male SD rats were randomized into three groups(n=10):the normal control group，the radiation control group，the APS plus radiation group.The structural changes of the leydig cells were observed with light microscope.The serum luteinizing hormone(LH)and testosterone(T)levels were measured by ELISA; and the mRNA expression level of luteinizing hormone receptor(LHR)from the leydig cells surface was measured by RTPCR.Results:Compared with the normal control group，the leydig cells exhibited decreases in size，cytoplasm，and quantity as well as the nuclear shrinkage after radiation.The mRNA expression levels of LHR were lower(P＜0.01);in the APS irrigation group，the pathological changes of leydig cells were lightly.The mRNA expression levels were close to the normal; the serum LH and T levels were no significant change.Conclusion:APS can reduce the impairment of the leydig cells caused by the higher doses60Co γ ray in rats，which may be involved in its induce the high expression of LHR mRNA.

R285.5;R697.22

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.013

*河南省科技攻關基金資助項目 102102310067

(2011-12-11收稿 責任編輯趙秋民)