表沒食子兒茶素沒食子酸酯對A549細胞增殖、凋亡和hTERT表達的影響

張 莎，袁 君，張貴星，張菊娥

鄭州大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室鄭州 450001

#通訊作者，女，1953年10月生，碩士，教授，研究方向:腫瘤酶學，E-mail:Zje8866@126.com

表沒食子兒茶素沒食子酸酯對A549細胞增殖、凋亡和hTERT表達的影響

張 莎，袁 君，張貴星，張菊娥#

鄭州大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室鄭州 450001

#通訊作者，女，1953年10月生，碩士，教授，研究方向:腫瘤酶學，E-mail:Zje8866@126.com

表沒食子兒茶素沒食子酸酯;人端粒酶逆轉錄酶;肺腫瘤;A549細胞

目的:探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對人肺腺癌細胞株A549細胞增殖、凋亡及人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)表達的影響。方法:用0、50、100、150、200、250 mg/L EGCG分別作用A549細胞24、48和72 h后，MTT比色法檢測細胞增殖抑制率;0、100、200、250 mg/L EGCG干預48 h后，應用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測A549細胞的凋亡情況，應用RT-PCR和免疫細胞化學分別檢測細胞內hTERT mRNA和蛋白的表達。結果:EGCG可抑制A549細胞的增殖，并隨著劑量增加和時間延長，抑制率增加(F組間=185.944，F時間=291.234，F交互= 4 186.119，P均＜0.001)。EGCG促進A549細胞凋亡(F=2 757.183，P＜0.001)，還可抑制 A549細胞中hTERT mRNA與蛋白的表達(F=260.861和953.327，P均＜0.001)。結論:EGCG能有效地抑制 A549細胞的增殖，誘導其凋亡，其機制可能與下調hTERT的表達有關。

端粒酶的活化是腫瘤發生中最普遍的事件，人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)作為調節端粒酶活性的主要因子在腫瘤的發生、發展中起著至關重要的作用，因此也成為了近年來腫瘤靶向治療領域的研究熱點。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是綠茶茶多酚中生物活性最強的單體，作為一種傳統的中藥成分，其藥理作用主要表現為抗氧化、抗炎癥、抗突變、抗腫瘤生成、抑制端粒酶活性等［1-2］。研究發現其對乳癌［3］、肝癌［4］、喉癌［5］等都有一定的抑制作用，同時能使癌組織端粒酶活性降低，hTERT表達減少。作者檢測了EGCG對人肺腺癌細胞株A549增殖、凋亡以及hTERT表達的影響，進一步探討其抗腫瘤作用的可能機制，以期為肺癌的治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 A549細胞由鄭州大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室傳代并保存。EGCG購自成都曼思特公司;DMEM高糖培養基和胎牛血清為美國Gibco公司產品;MTT購自美國Sigma公司;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒為南京凱基生物有限公司產品;RNAiso Plus、M-MLV反轉錄酶、Premix Taq Version 2.0等購自TaKaRa公司;兔抗人hTERT多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產品;SP免疫組化試劑盒為北京中杉金橋服務有限公司產品。

1.2 A549細胞增殖情況的檢測 采用MTT法。取對數生長期的A549常規消化制成單細胞懸液，調整細胞密度為4×107L－1，接種于96孔板中，每孔0.2 mL。培養24 h后，加入終濃度為50、100、150、200、250 mg/L的EGCG，以只加等體積培養基的細胞作為對照，同時設不加細胞只加培養基的調零孔，每個濃度設3個復孔。分別在培養箱中培養24、48和72 h后，各孔加5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續在培養箱中孵育4 h，小心吸棄上清，每孔加入150 μL的DMSO。酶標儀上測定其在490 nm處的吸光度(A)值，計算各時間點的細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率 =(1－處理組 A值/對照組 A值)×100%。實驗重復3次。

1.3 A549細胞凋亡情況的檢測 采用Annexin VFITC/PI雙染法檢測。取對數生長期的A549細胞，用DMEM高糖完全培養基調整細胞密度為2×108L－1，接種于培養瓶中，在體積分數為5%的CO2、37℃培養箱中培養。次日每瓶加入不同質量濃度的EGCG，使藥物終濃度分別為0、100、200、250 mg/L。繼續培養48 h后取出A549細胞，用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞。加PBS 6 mL洗滌，2 000 r/ min離心5 min，重復2次，收集1×106個細胞于EP管中。加入0.5 mL的Binding Buffer，使細胞懸浮。加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入 5 μL PI，混勻，室溫、避光孵育15 min。在1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.4 A549細胞中hTERT mRNA的檢測 采用RT-PCR法檢測。按照 RNAiso Plus試劑說明書提取EGCG處理48 h后A549細胞的總RNA并定量，經M-MLV逆轉錄酶合成cDNA。根據Genbank資料，用Primer Premier 5軟件設計hTERT引物序列。hTERT上游:5’-TCACCTCGAGGGTGAAGGCACTGTT-3’，下游:5’-ATGCTGGCGATGACCTCCGTGA-3’，擴增片段大小230 bp。內參 β-actin上游:5’-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3’，下游:5’-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3’，擴增片段大小139 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應體系:2×premix Taq 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA模板1 μL，補雙蒸水至20 μL。PCR反應條件:94℃3 min;94℃ 45 s，60℃30 s，72℃1 min，35個循環;72℃ 10 min。RTPCR產物經15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統下觀察結果并拍照。

1.5 A549細胞內hTERT蛋白的檢測 采用免疫細胞化學檢測。取對數生長期的A549細胞，用DMEM高糖完全培養基調整細胞密度為4×107L－1，每孔2 mL，接種于鋪有蓋玻片的6孔培養板中。次日吸去培養基，分別加入含不同質量濃度的EGCG(0、100、200、250 mg/L)的培養基，48 h后終止培養，PBS沖洗2次，用質量分數為4%的多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次。之后加入體積分數為1%的Triton-X溶液通透20 min，浸入PBS中洗3次。實驗參照免疫組化 SP試劑盒說明書進行。hTERT稀釋一抗100倍后使用，以PBS代替一抗作為陰性對照。高倍鏡下選取5個視野觀察，IPP 6.0軟件分析結果，計算各視野的平均光密度值(AOD)值。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0分析。EGCG對A549細胞增殖活性的影響采用析因設計的方差分析，各組A549細胞凋亡率、hTERT mRNA和蛋白表達的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 EGCG對A549細胞增殖活性的影響 A549細胞增殖抑制率測定結果見表1。

表1 EGCG對A549細胞增殖抑制率的影響(n=3)%

2.2 EGCG對A549細胞凋亡的影響 見表2。

表2 EGCG干預48 h后各組A549細胞凋亡率和hTERT表達的比較(n=3)

2.3 EGCG對A549細胞hTERT mRNA表達的影響 見圖1、表2。

2.4 EGCG對A549細胞hTERT蛋白表達的影響見圖2、表2。hTERT蛋白主要表達于胞質，胞核中有少量表達，呈黃色或棕褐色。

圖1 PCR擴增hTERT基因瓊脂糖凝膠電泳結果

圖2 A549細胞中hTERT蛋白的表達(SP，×400)

3 討論

EGCG能抑制多種腫瘤細胞生長并促其凋亡，而對人體的正常細胞幾乎無毒副作用［5-7］。該研究結果顯示EGCG的濃度在50～250 mg/L時，隨著EGCG劑量的增加及作用時間的延長，A549細胞增殖抑制率逐漸升高，表明EGCG能夠抑制A549細胞生長，其作用呈現時間及劑量的依賴關系。在該濃度范圍內，EGCG作用48 h后，A549細胞的凋亡率隨著給藥濃度的增加而升高，EGCG促進了A549細胞的凋亡。

端粒是存在于真核細胞線狀染色體末端的DNA重復序列，其主要功能是維持染色體的穩定性。hTERT是端粒酶必需的催化亞單位，它只特異性地在端粒酶陽性的腫瘤細胞和永生化細胞中表達，而正常細胞中幾乎檢測不到［2，8］。A549細胞為端粒酶陽性表達細胞，是端粒酶研究中較理想的實驗模型。該研究發現隨著EGCG作用濃度的增加，A549細胞中hTERT mRNA和蛋白的表達均明顯受到抑制。因此推測EGCG抑制A549細胞生長可能與其促凋亡作用有關，而誘導細胞凋亡的可能機制在于下調hTERT的表達。

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［3］Meeran SM，Patel SN，Chan TH，et al.A novel prodrug of epigallocatechin-3-gallate:differential epigenetic hTERT repression in human breast cancer cells［J］.Cancer Prev Res(Phila)，2011，4(8):1243

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［6］Singh M，Singh R，Bhui K，et al.Tea polyphenols induce apoptosis through mitochondrial pathway and by inhibiting nuclear factor-kappaB and Akt activation in human cervical cancer cells［J］.Oncol Res，2011，19(6):245

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Effects of epigallocatechin-3-gallate on growth and hTERT expression of A549 cells

ZHANG Sha，YUAN Jun，ZHANG Guixing，ZHANG Ju’eDepartment of Biochemistry and Molecular Biology，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

epigallocatechin-3-gallate;human telomerase reverse transcriptase;lung neoplasm;A549 cell

Aim:To investigate the effects of epigallocatechin-3-gallate(EGCG)on proliferation and apoptosis and the expression of human telomerase reverse transcriptase(hTERT)of human lung adenocarcinoma cell line A549.Methods:A549 cells were treated with 0，50，100，150，200，250 mg/L EGCG for 24，48，and 72 h，respectively.MTT assay was used to detect the inhibitory rate of cell proliferation.Flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining was employed to analyze the apoptosis of A549 cells treated with various concentrations of EGCG(0，100，200，250 mg/L)for 48 h，and RTPCR and immunocytochemistry were applied to detect the mRNA and protein expression of hTERT.Results:EGCG inhibited the cell proliferation of A549 in a dose dependent manner(Fgroup=185.944，Ftime=291.234，Finteraction=4 186.119，P＜0.001)，and promoted the apoptosis of A549 cells(F=2 757.183，P＜0.001).EGCG could suppress the mRNA and protein expression of hTERT(F=260.861 and 953.327，P＜0.001).Conclusion:EGCG can effectively inhibit cell proliferation and induce apoptosis of A549 cells，which may be associated with downregulation of hTERT expression.

R734.2

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.018

(2012-03-01收稿 責任編輯李沛寰)