左卡尼汀對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織MPO和NO含量的影響

許益笑，張睿喆，王德選，倪世容，王萬(wàn)鐵，鄭綠珍，王 麗，熊錫山，郭坤元

1)南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院血液科廣州 510282 2)溫州醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室溫州 325000 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院鄭州 450001 4)上海長(zhǎng)征醫(yī)院腎臟病研究所上海 200030

#通訊作者，男，1964年5月生，博士，教授，研究方向:白血病診治，E-mail:gzyuan@pub.guangzhou.gd.cn

左卡尼汀對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織MPO和NO含量的影響

許益笑1，2)，張睿喆3)，王德選2)，倪世容2)，王萬(wàn)鐵2)，鄭綠珍2)，王 麗4)，熊錫山4)，郭坤元1)#

1)南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院血液科廣州 510282 2)溫州醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室溫州 325000 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院鄭州 450001 4)上海長(zhǎng)征醫(yī)院腎臟病研究所上海 200030

#通訊作者，男，1964年5月生，博士，教授，研究方向:白血病診治，E-mail:gzyuan@pub.guangzhou.gd.cn

左卡尼汀;腎臟;缺血再灌注損傷;髓過(guò)氧化物酶;一氧化氮;大鼠

目的:探討左卡尼汀對(duì)腎缺血再灌注損傷(RIRI)大鼠能量代謝的影響及其機(jī)制。方法:健康SD大鼠48只，隨機(jī)分為對(duì)照組和左卡尼汀組，每組24只。2組大鼠均建立RIRI模型，左卡尼汀治療組大鼠缺血前15 min及再灌注(IR)后40 min尾靜脈注射左卡尼汀500 mg/kg，2組分別于IR 0、1、6和12 h各處死6只大鼠。檢測(cè)各組大鼠血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)、腎組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)和一氧化氮(NO)含量，并觀察腎組織病理變化。結(jié)果:2組IR 0、1、6、12 h大鼠血清BUN和Cr比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=5.116和6.602，F(xiàn)時(shí)間=15.235和47.118，P均＜0.05)，2組IR 6、12 h較IR 0 h升高，左卡尼汀組IR 6、12 h較對(duì)照組下降(P＜0.05)。2組IR 0、1、6、12 h大鼠腎組織MPO和NO含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=6.259和3.729，F(xiàn)時(shí)間=7.709和39.671，P均＜0.05)。2組IR 12 h大鼠腎組織MPO含量較IR 0 h升高，左卡尼汀組IR 12 h大鼠腎組織MPO含量低于對(duì)照組(P＜0.05);2組IR 12 h大鼠腎組織NO含量較IR 0 h降低，左卡尼汀組IR 12 h大鼠腎組織NO含量高于對(duì)照組(P＜0.05)。左卡尼汀組IR 6和12 h大鼠腎小管損傷明顯減輕。結(jié)論:左卡尼汀對(duì)腎缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與減少中性粒細(xì)胞聚集，降低腎組織MPO釋放，增加NO合成有關(guān)。

缺血性急性腎功能衰竭(acute renal failure，ARF)是常見(jiàn)臨床綜合征，病死率較高，且由于體外循環(huán)等高難度手術(shù)的開(kāi)展，其發(fā)病率近年來(lái)有明顯升高趨勢(shì)［1］。腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是缺血性ARF最主要的病理生理變化之一。作者前期的研究［2］發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性脂肪酸代謝輔助因子左卡尼汀(L-carnitine)對(duì)RIRI有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其增強(qiáng)SOD活性，降低腎臟過(guò)氧化程度有關(guān)。該研究主要通過(guò)觀察應(yīng)用左卡尼汀后，RIRI大鼠腎組織髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)及一氧化氮(nitrogen monoxide，NO)含量的改變，進(jìn)一步深入探討左卡尼汀對(duì)RIRI影響的作用機(jī)制，以期為臨床上防治RIRI提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 左卡尼汀注射液由常州蘭陵制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為 0003271，劑型 5 mL/g。MPO、NO測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。其余試劑均為市售分析純品。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量250～300 g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。48只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和左卡尼汀組，每組24只，均制作RIRI模型［3］。左卡尼汀組缺血前15 min及再灌注后40 min兩次尾靜脈注射左卡尼汀(500 mg/kg)［4］，對(duì)照組相同時(shí)間點(diǎn)注射等體積生理鹽水。各組大鼠均分別于缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)0、1、6和12 h各處死6只，切除左腎。

1.3血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)檢測(cè) 各組大鼠左腎切除前于眼框后取血1 mL，注入空白離心管，于4℃、3 000 r/min離心10 min后取上清送第二軍醫(yī)大學(xué)新藥評(píng)價(jià)中心檢測(cè)血BUN和Cr。

1.4 腎皮質(zhì)組織MPO、NO含量測(cè)定 沿冠狀面切開(kāi)大鼠左腎，于靠近下極處切取腎皮質(zhì)組織約200 mg，加生理鹽水制成體積分?jǐn)?shù)為2%的勻漿，4℃，3 500 r/min離心5 min，取上清液，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)MPO和NO含量。

1.5 腎病理組織學(xué)觀察^ 于靠近腎下極處切取約0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小的組織數(shù)塊，經(jīng)40 g/ L多聚甲醛加DEPC固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡(×200)下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用2×4析因設(shè)計(jì)的方差分析比較各組大鼠血清BUN和Cr、腎皮質(zhì)組織MPO和NO含量，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清BUN和Cr含量的比較 見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠腎皮質(zhì)組織NO和MPO含量的比較 見(jiàn)表2。

2.3 腎臟組織病理變化 IR 0和1 h后2組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯病理性改變。IR 12 h后對(duì)照組大鼠腎組織可見(jiàn)近曲小管顯著水腫，大量上皮細(xì)胞壞死脫落，管腔狹窄，其中可見(jiàn)大量管型，淤血明顯，較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);IR 6、12 h后左卡尼汀組大鼠可見(jiàn)近曲小管近曲輕度水腫，管腔稍狹窄，淤血及中性粒細(xì)胞較對(duì)照組顯著減少。

表1 各組大鼠血清BUN和Cr含量的比較(n=6)

表2 各組大鼠腎皮質(zhì)MPO和NO含量的比較(n=6)

3 討論

該實(shí)驗(yàn)采用Takada等［3］的方法，切除大鼠右腎，左腎單側(cè)行RI，復(fù)制RIRI模型。結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠血BUN和Cr升高，且隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而更加明顯，提示大鼠的腎功能在再灌注后顯著受損;腎組織病理組織學(xué)檢查亦顯示近曲小管顯著水腫，大量上皮細(xì)胞壞死脫落，管腔狹窄伴大量管型，均表明RIRI模型制作成功。

左卡尼汀是一種氨基酸衍生物，可通過(guò)提高位于線粒體膜上卡尼汀脂酰轉(zhuǎn)移酶的活性，加速轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化供能，與脂肪酸的利用及能量生成密切相關(guān)。左卡尼汀具有促進(jìn)心肌再灌注期糖的有氧氧化，調(diào)節(jié)糖、脂肪酸氧化的平衡，改善心肌的能量代謝、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和抗氧化作用［5］，在臨床上已開(kāi)始應(yīng)用于心肌梗死、中重度心力衰竭及體外循環(huán)手術(shù)患者［6］。作者應(yīng)用左卡尼汀干預(yù)RIRI大鼠，結(jié)果顯示IR 6、12 h左卡尼汀組大鼠血BUN和Cr較對(duì)照組顯著下降，光鏡下可見(jiàn)腎組織損傷顯著減輕，提示左卡尼汀可改善腎功能，保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞，減輕RIRI。

中性粒細(xì)胞的聚集和浸潤(rùn)為缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。早在上個(gè)世紀(jì)90年代Kelly等［7］就發(fā)現(xiàn)，預(yù)先用抗白細(xì)胞血清處理RIRI小鼠，使血白細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)＜100個(gè)/mm3，其腎臟損傷程度明顯輕于未處理組。RIRI時(shí)，過(guò)多的氧自由基可增加微血管通透性，引起腎組織間質(zhì)水腫，血管擴(kuò)張，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死以及中性粒細(xì)胞活化。而大量聚集活化的中性粒細(xì)胞一方面可堵塞毛細(xì)血管引起無(wú)復(fù)流現(xiàn)象，加重局部微循環(huán)障礙的缺血、缺氧，另一方面可大量釋放活性氧和細(xì)胞毒性物質(zhì)如蛋白酶、MPO、乳鐵蛋白等，造成進(jìn)一步損傷［8］。MPO是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞氧依賴(lài)性殺菌系統(tǒng)的重要組分，可利用過(guò)氧化氫和氯離子產(chǎn)生次氯酸鹽，并形成具有氧化能力的自由基，從而損傷腎組織細(xì)胞，最終可致腎功能衰竭，檢測(cè)MPO的含量能反應(yīng)組織中中性粒細(xì)胞聚集的數(shù)量和活化程度［9］。該研究結(jié)果表明，各組大鼠腎組織中MPO含量隨著再灌注時(shí)間的增加而逐漸升高，提示腎組織中的白細(xì)胞滯留、聚積增多、參與了腎臟損傷的病理生理過(guò)程。而應(yīng)用左卡尼汀后MPO含量較對(duì)照組顯著下降，病理組織學(xué)觀察顯示中性粒細(xì)胞滲出顯著減少，提示左卡尼汀可減少RIRI后中性粒細(xì)胞的聚集和活化，從而減輕IR損傷。

作者還發(fā)現(xiàn)，隨著缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠腎組織中NO含量逐漸下降，IR 6 h后出現(xiàn)顯著性改變，與文獻(xiàn)［9］報(bào)道相符。在活性氧中，NO為近年來(lái)人們關(guān)注的熱點(diǎn)，由內(nèi)皮細(xì)胞生成的少量NO主要參與血管生理調(diào)節(jié)，如舒張血管、抑制白細(xì)胞黏附等。RIRI時(shí)，內(nèi)皮缺血缺氧，NO產(chǎn)生減少，大量白細(xì)胞黏附聚集于內(nèi)皮細(xì)胞表面，然后浸潤(rùn)至組織，釋放出更多的氧自由基，加重組織損傷。Korish等［10］發(fā)現(xiàn)慢性腎臟衰竭時(shí)，左旋精氨酸可通過(guò)上調(diào)NO表達(dá)來(lái)對(duì)抗氧自由基的形成和中性粒細(xì)胞聚集。該研究結(jié)果顯示，左卡尼汀治療組IR 12 h處死大鼠NO含量較同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組大鼠下降趨勢(shì)減緩，與MPO呈反向變化，提示左卡尼汀對(duì)中性粒細(xì)胞活化的抑制作用可能與其對(duì)NO合成的促進(jìn)有關(guān)，但二者的確切因果關(guān)系尚有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，左卡尼汀對(duì)急性RIRI具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與減少中性粒細(xì)胞的聚集，降低腎組織MPO含量，增加NO含量有關(guān)。

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Effects of L-carnitine on the contents of MPO and NO in rats with renal ischemic reperfusion injury

XU Yixiao1，2)，ZHANG Ruizhe3)，WANG Dexuan2)，NI Shirong2)，WANG Wantie2)，ZHENG Lvzhen2)，WANG Li4)，XIONG Xishan4)，GUO Kunyuan1)1)Department of Hematology，Zhujiang Hospital，Nanfang Medical University，Guangzhou 510282 2)Department of Pathophysiology，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000 3)College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 4)Kidney Disease Research Institute，Shanghai Changzheng Hospital，Shanghai 200030

L-carnitine;kidney;ischemia reperfusion injury;myeloperoxidase;nitrogen monoxidum;rat

Aim:To investigate possible mechanisms involved in the protection of L-carnitine against renal ischemic reperfusion injury(RIRI)in rats.Methods:A total of 48 SD healthy rats were divided into control and L-carnitine groups (n=24).Model of RIRI was established in the two groups，and 6 rats were killed at ischemic reperfusion(IR)0，1，6，and 12 h.The contents of serum urea nitrogen(BUN)and creatinine(Cr)，the myeloperoxidase(MPO)and NO in nephridial tissue were measured.The pathological changes in renal tissue were observed.Results:In the two groups，Cr and BUN contents of the IR 0，1，6，12 h rats were obviously different(Fgroup=5.116 and 6.602，F(xiàn)time=15.235 and 47.118，P＜0.05).Comparing with those of IR 0 h killed rats，Cr and BUN contents of the IR 6 and 12 h killed rats increased significantly;Cr and BUN contents of the IR 6 and 12 h killed rats were lower in L-carnitine group than those in the control group(P＜0.05).In the two groups，MPO and NO contents of the IR 0，1，6，12 h rats were obviously different(Fgroup=6.259 and 3.729，F(xiàn)time=7.709 and 39.671，P＜0.05).Comparing with those of IR 0 h killed rats，MPO content of the IR 12 h killed rats increased significantly in the two groups;MPO content of the IR 12 h killed rats was higher in control group than that in the L-carnitine group(P＜0.05).In the two groups，comparing with those of IR 0 h killed rats，NO content of the IR 12 h killed rats decreased significantly;NO content of the IR 12 h killed rats was lower in control group than that in the L-carnitine group(P＜0.05).In addition，renal histological injuries were attenuated after L-carnitine administration.Conclusion: L-carnitine protects kidney against acute RIRI through inhibiting neutrophil aggregation，lowering the release of MPO and increasing the synthesis of NO in the renal tissue.

R692.5

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.019

(2011-12-05收稿 責(zé)任編輯李沛寰)