重鉻酸鉀對A549細胞MSH2 mRNA及蛋白表達的影響

畫寶勇，馬麗華，李時恩

1)鄭州大學公共衛生學院勞動衛生學教研室鄭州 450001 2)鄭州大學口腔醫學院鄭州 450052

#通訊作者，男，1975年11月生，碩士，副教授，研究方向:公共衛生與預防醫學，E-mail:hby@zzu.edu.cn

重鉻酸鉀對A549細胞MSH2 mRNA及蛋白表達的影響

畫寶勇1)#，馬麗華2)，李時恩1)

1)鄭州大學公共衛生學院勞動衛生學教研室鄭州 450001 2)鄭州大學口腔醫學院鄭州 450052

#通訊作者，男，1975年11月生，碩士，副教授，研究方向:公共衛生與預防醫學，E-mail:hby@zzu.edu.cn

重鉻酸鉀;MSH2基因;錯配修復基因;A549細胞

目的:研究重鉻酸鉀(K2Cr2O7)對A549細胞MSH2 mRNA及蛋白表達的影響。方法:體外培養條件下用0、1.25×10－6、2.50×10－6及5.00×10－6μmol/L的K2Cr2O7溶液染毒A549細胞24 h后，分別用MTT法、Realtime PCR及Western blot方法檢測細胞活性、MSH2 mRNA及蛋白的表達。結果:隨K2Cr2O7作用濃度的升高，A549細胞活性、MSH2 mRNA相對表達量和蛋白表達量均逐漸降低(F=175.040、66.128和33.326，P＜0.001)。結論: K2Cr2O7影響A549細胞的損傷修復。

六價鉻是一種重金屬環境污染物，已被證實具有致癌性，有較強的氧化能力，可以導致DNA損傷，干擾DNA修復。MSH2是高度保守的DNA錯配修復基因，可以預防自發突變的堆積，保證DNA復制的完整性和穩定性［1］。MSH2蛋白能與DNA雙鏈中的G-T、A-C錯配特異結合，還能與(CA)4及含14個堿基的插入/缺失環錯配結合［2］。現已證實其基因突變與一些散發性腫瘤的發病危險性相關，如皮膚癌、直腸癌、胃癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌及子宮內膜癌等［3-4］。基于以上分析，該研究旨在探討重鉻酸鉀(K2Cr2O7)對人胚肺A549細胞MSH2 mRNA及蛋白表達的影響，為進一步研究六價鉻致癌機制提供思路。

1 材料與方法

1.1 細胞來源與主要試劑 A549細胞購于武漢大學中國典型培養物保藏中心。胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DMEM/F12培養基(美國Gibco公司)。總RNA提取試劑盒(寶生物工程有限公司)，人MSH2擴增引物、人GAPDH擴增引物、Real time PCR試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)，兔抗人β-actin單克隆抗體、兔抗人MSH2單克隆抗體、辣根酶標記羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術公司)，ECL顯色試劑盒(美國PIERCE公司)，MTT(美國Sigma公司)。

1.2 實驗分組 用含體積分數10%胎牛血清的DMEM/F12培養基在37℃、體積分數5%CO2條件下常規培養A549細胞，1～2 d換液1次，待細胞長至倒置顯微鏡下80%視野進行傳代，然后取對數生長期細胞進行實驗。消化A549細胞，按每孔3.5× 104個細胞接種于96孔板，于37℃、體積分數5% CO2培養箱中培養，待細胞貼壁后棄原培養液，分別加入含0、1.25×10－6、2.50×10－6及5.00×10－6μmol/L K2Cr2O7的無血清DMEM/F12培養液，每濃度組設6個復孔，于37℃、體積分數5%CO2培養箱繼續培養24 h，進行下列指標檢測。

1.3 觀測指標

1.3.1 細胞增殖抑制率 收集各組細胞，MTT法檢測細胞活性，檢測波長495 nm，以光密度(OD)值反映細胞活性。

1.3.2 細胞中MSH2 mRNA的檢測 Trizol法提取細胞總RNA，鑒定其純度和完整性以后，逆轉錄合成cDNA，以此為模板，以GAPDH為內參，進行Real time PCR。使用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計。MSH2引物序列:上游5’-GGTGTCCATATGAG GCGTAT-3’，下游 3’-TGAAGTTGTCGCTGTGACG GT-5’，產物大小166 bp;GADPH引物序列:上游5’-GGGAAACTGTGGCAGTGGAT-3’，下游 3’-TGAAGTTGTCGCTGTGACGGT-5’，產物大小 100 bp。擴增體系為25 μL，反應條件:segment 1為95℃30 s 1個循環;segment 2為95℃5 s，60℃20 s，40個循環。計算 2－ΔΔCt。ΔCt = Ct目的基因－Ct內參，ΔΔCt=△Ct實驗組－ΔCt對照組。

1.3.3 細胞中MSH2蛋白的檢測 提取各組支持細胞中總蛋白，BradFord法進行蛋白定量，計算蛋白濃度，繪制標準曲線，確定蛋白上樣量。然后用Western blot法檢測MSH2蛋白，一抗按300倍稀釋，二抗按500倍稀釋。經聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、抗體免疫反應、化學發光、定影顯影等步驟，最后使用GENESNAP軟件對所得的結果做半定量分析。以目的蛋白與GAPDH條帶光密度值的比值代表目的蛋白相對表達量。

1.4 統計學處理 采用SPSS 12.0進行數據處理，采用單因素方差分析比較不同濃度組A549細胞的細胞活性、MSH2 mRNA和蛋白的表達量，兩兩比較應用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 K2Cr2O7作用后A549的細胞活性變化K

2Cr2O7處理 A549細胞 24 h后，細胞活性隨K2Cr2O7濃度的升高而降低，見表1。

2.2 K2Cr2O7作用后A549細胞MSH2 mRNA及蛋白的表達 K2Cr2O7處理 A549細胞24 h后，MSH2 mRNA和蛋白的相對表達量隨K2Cr2O7濃度的升高而降低，見表1。

表1 K2Cr2O7作用后A549細胞活性、MSH2 mRNA及蛋白的表達

3 討論

鉻是一種天然金屬元素，六價鉻是一種重金屬環境污染物，主要存在于工業生產中，并已被證實具有致癌性［5］。錯配修復基因是生物進化過程中的保守基因，屬管家基因，具有識別、修復DNA堿基錯配、增強DNA復制的忠實性、維持基因組穩定性和降低自發性突變的功能，在多種腫瘤組織中具有不同的表達譜。近年來，錯配修復基因在腫瘤組織中的作用是研究的熱點。Zhitkovich［6］發現錯配修復基因缺陷細胞染毒六價鉻后細胞存活率高于正常細胞，認為錯配修復基因在六價鉻誘導的細胞毒性中起著促進或協同作用。Kouso等［7］使用免疫組織化學法檢測發現，113例非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者癌組織hMSH2蛋白表達顯著減少，hMSH2的表達與吸煙狀態有很大的關聯。Xinarianos等［8］研究了150例NSCLC患者癌組織中hMSH2蛋白的表達水平，發現hMSH2蛋白低表達對肺癌的發生有著重要的影響。

作者觀察到，隨著K2Cr2O7作用濃度的增高，A549細胞的活性逐漸降低，MSH2蛋白和mRNA的相對表達量也逐漸降低。由此得知，K2Cr2O7對A549細胞的抗損傷修復能力產生了影響，損傷的細胞如果沒有修復或者死亡而繼續復制，使大量錯誤信息在細胞內不斷積聚，可能最終導致細胞性質改變。

［1］Trouiller B，Schaefer DG，Charlot F，et al.MSH2 is essential for the preservation of genome integrity and prevents homeologous recombination in the moss Physcomitrella patens［J］.Nucleic Acids Res，2006，34(1):232

［2］李瑛，許建寧.001 DNA錯配修復基因 hMSH2與腫瘤關聯的研究進展［J］.國外醫學:衛生學分冊，2008，35 (1):1

［3］Gomez RL，Galles C，Spampinato CP.High-level production of MSH2 from Arabidopsis thaliana:a DNA mismatch repair system key subunit［J］.Mol Biotechnol，2011，47(2): 120

［4］Li T，Suo Q，He D，et al.Esophageal cancer risk is associated with polymorphisms of DNA repair genes MSH2 and WRN in Chinese population［J］.J Thora Oncol，2012，7 (2):448

［5］Thompson CM，Haws LC，Harris MA，et al.Application of the US EPA mode of action Framework for purposes of guiding future research:a case study involving the oral carcinogenicity of hexavalent chromium［J］.Toxicol Sci，2011，119(1):20

［6］Zhitkovich A.Chromium in drinking water:sources，metabolism and cancer risks［J］.Chem Res Toxicol，2011，24 (10):1617

［7］Kouso H，Yoshino I，Miura N，et al.Expression of mismatch repair proteins，hMLH1/hMSH2，in non-small cell lung cancer tissues and its clinical significance［J］.J Surg Oncol，2008，98(5):377

［8］Xinarianos G，Liloglou T，Prime W，et al.hMLH1 and hMSH2 expression correlates with allelic imbalance on chromosome 3p in non-small cell lung carcinomas［J］.Cancer Res，2000，60(15):4216

Effects of potassium bichromate on expression of MSH2 mRNA and protein in A549 cells

HUA Baoyong1)，MA Lihua2)，LI Shi’en1)1)Department of Occupational Health，College of Public Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 2)College of Stomatology，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

potassium bichromate;MSH2;mismatch repair gene;A549 cell

Aim:To observe the effect of potassium bichromate on the expression of MSH2 mRNA and protein in A549 cells.Methods:A549 cells were treated with 0，1.25×10－6，2.50×10－6and 5.00×10－6μmol/L potassium bichromate for 24 h，then cells survival ability，the expressions of MSH2 mRNA and protein were detected by MTT，Real time PCR and Western blot methods，respectively.Results:Cells survival ability，the MSH2 mRNA and protein expression in A549 cells decreased with the potassium bichromate concentration increasing(F=175.040，66.128 and 33.326，P＜0.001).Conclusion:Potassium bichromate can affect the ability of damage repair of A549 cells.

R135.1

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.029

(2012-03-14收稿 責任編輯王 曼)