用苧麻生物脫膠廢水生產(chǎn)熱帶假絲酵母單細(xì)胞蛋白

王 軍，郝新艷，殷朝敏，蔡 蔭 ，曾慶福，阮新潮

（1. 武漢紡織大學(xué) 紡織印染清潔生產(chǎn)教育部工程研究中心，湖北 武漢 430073；2. 武漢紡織大學(xué) 環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430073）

用苧麻生物脫膠廢水生產(chǎn)熱帶假絲酵母單細(xì)胞蛋白

王 軍1，郝新艷1，殷朝敏2，蔡 蔭2，曾慶福1，阮新潮1

（1. 武漢紡織大學(xué) 紡織印染清潔生產(chǎn)教育部工程研究中心，湖北 武漢 430073；2. 武漢紡織大學(xué) 環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430073）

采用熱帶假絲酵母處理苧麻生物脫膠廢水。將COD為23 060 mg/L的苧麻生物脫膠廢水稀釋1倍后進(jìn)行發(fā)酵處理，COD去除率最高，為60.85%。發(fā)酵條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在發(fā)酵溫度為35 ℃、初始發(fā)酵pH為7.0、接種量為 10%、發(fā)酵時(shí)間為48 h的條件下，苧麻生物脫膠廢水COD去除率最高；發(fā)酵溫度為30 ℃、初始發(fā)酵pH為7.0、接種量為 10%、發(fā)酵時(shí)間為48 h的條件下，單細(xì)胞蛋白生成量最高。發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率為75.75%，單細(xì)胞蛋白生成量為5.375 g/L；未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率為72.25%，單細(xì)胞蛋白生成量為2.875 g/L。

熱帶假絲酵母；苧麻；生物脫膠；發(fā)酵；單細(xì)胞蛋白；廢水處理

苧麻纖維是我國(guó)重要的紡織原料之一。苧麻的主要化學(xué)組成是纖維素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%～70%，其余為半纖維素、果膠、木質(zhì)素、水溶物、蠟脂質(zhì)、灰分等［1］，統(tǒng)稱為苧麻膠質(zhì)。苧麻膠質(zhì)影響纖維的可紡性［2］，必須從苧麻中脫除。苧麻脫膠有化學(xué)脫膠和生物脫膠兩種方法。化學(xué)脫膠成本高，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重［3-4］。生物脫膠具有可提高精干麻質(zhì)量、不損傷纖維、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)［5］，是苧麻脫膠技術(shù)的主要發(fā)展方向。苧麻經(jīng)生物菌液或酶液脫膠處理后，苧麻膠質(zhì)被降解成小分子多糖［5］，所以苧麻生物脫膠廢水屬于高濃度有機(jī)廢水，可生化性較強(qiáng)［6］。

熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）體內(nèi)含有氧化分解酶，能降解可生化性較好的有機(jī)廢水，并同時(shí)獲得酵母蛋白，既消除了環(huán)境污染，又可使有機(jī)廢水得到綜合利用。目前熱帶假絲酵母已成功用于食品、造紙等工業(yè)廢水的處理［7-8］。

本工作利用熱帶假絲酵母處理苧麻生物脫膠廢水，同時(shí)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白，對(duì)苧麻生物脫膠廢水進(jìn)行了綜合利用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑和儀器

未稀釋的初始苧麻生物脫膠廢水COD為23 060 mg/L。熱帶假絲酵母篩選自湖北天化麻業(yè)股份有限公司脫膠廠漚麻池的漚麻液。苧麻生物脫膠廢水取自武漢紡織大學(xué)環(huán)境科學(xué)研究所，經(jīng)脫膠微生態(tài)菌群［9］處理。所用試劑均為分析純。

保藏培養(yǎng)基［10］：酵母膏2.0 g，蛋白胨3.0 g，瓊脂粉 20 g，葡萄糖10 g，定容至1.0 L，121℃滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，牛肉膏 5 g，酵母粉5 g，蛋白胨20 g，氯化鈉5 g，定容至 1.0 L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 m in。

發(fā)酵培養(yǎng)基：在250 m L三角瓶中裝入 l00 m L適當(dāng)稀釋的苧麻生物脫膠廢水，加入一定量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3% 的（NH4）2HPO4溶液調(diào)節(jié)廢水pH，121 ℃滅菌20 min。

THZ-D型恒溫?fù)u床：太倉(cāng)試驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 菌種鑒定

抽提菌種基因組總DNA，用引物NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和引物NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR ）擴(kuò)增其26s rDNA［11］。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后克隆到pMD18-T載體， 送北京三博遠(yuǎn)志公司對(duì)26s rDNA基因序列進(jìn)行測(cè)序。在 GenBank 的序列局部相似性查詢系統(tǒng)（BLAST）內(nèi)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)所得菌種進(jìn)行鑒別。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子液的培養(yǎng)

用接種環(huán)將斜面上生長(zhǎng)的菌種接入到裝有 50 m L種子液培養(yǎng)基的250 m L三角瓶?jī)?nèi)，置于恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)24～48 h，備用。

1.3.2 苧麻生物脫膠廢水的發(fā)酵處理

將種子液按一定的接種量（體積分?jǐn)?shù)，下同）接入到不同初始COD的發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于180 r/m in恒溫?fù)u床上在一定溫度條件下發(fā)酵一定時(shí)間后測(cè)定其COD。

取一定量發(fā)酵后廢水，4 000 r/m in離心10 m in，去除上清液，剩余菌體用去離子水洗滌后，在 105 ℃烘箱中烘干至恒重，稱量菌體質(zhì)量，計(jì)算單細(xì)胞蛋白生成量（單位體積廢水中單細(xì)胞蛋白的質(zhì)量，g/L）。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌處理和未滅菌處理的效果對(duì)比

分別在經(jīng)過(guò)煮沸滅菌處理和未經(jīng)滅菌處理的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入種子液，在發(fā)酵溫度為35 ℃、初始發(fā)酵pH為7.0、接種量為 10%的條件下，連續(xù)發(fā)酵24 h后取樣測(cè)量廢水中COD和單細(xì)胞蛋白生成量，然后每隔6 h取樣分析，直至發(fā)酵時(shí)間達(dá)到48 h。比較發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌和不滅菌情況下的COD去除率和單細(xì)胞蛋白生成量。

1.4 分析方法

采用重鉻酸鉀法測(cè)定廢水COD［12］。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的鑒定

測(cè)序獲得菌種的26 s rDNAD1/D2區(qū)段序列如下，與熱帶假絲酵母菌的序列相似度達(dá)98%，因此該菌種鑒定為熱帶假絲酵母菌［13］。

2.2 初始廢水COD對(duì)COD去除率的影響

初始廢水COD對(duì)COD去除率的影響見表1。

表1 初始廢水COD對(duì)COD去除率的影響

由表1可見，初始廢水COD為11 530 mg/L時(shí)，COD去除率最高，為60.85%，故將苧麻生物脫膠廢水稀釋1倍后進(jìn)行發(fā)酵處理，COD去除效果最佳。這是因?yàn)槠r麻生物脫膠廢水中含有大量單糖、多糖等有機(jī)分子，其濃度過(guò)低時(shí)沒有足夠的底物用于菌體生長(zhǎng)；其濃度過(guò)高時(shí)，高濃度有機(jī)分子與抑制物的有害作用及其造成的滲透壓脅迫共同導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)受到抑制。

2.3 發(fā)酵條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為優(yōu)化發(fā)酵條件，設(shè)計(jì)了4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)L9（34）。 正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表2，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)廢水COD去除率的影響顯著性由強(qiáng)到弱順序依次為：A＞D＞B＞C，最優(yōu)方案為A1D2B3C3，即發(fā)酵溫度為35 ℃，初始發(fā)酵pH為7.0，接種量為 10%，發(fā)酵時(shí)間為48 h。

各因素對(duì)單細(xì)胞蛋白生成量的影響顯著性由強(qiáng)到弱順序依次為：B＞D＞C＞A，最優(yōu)方案為B3D2C2A1，即發(fā)酵溫度為30 ℃，初始發(fā)酵pH為7.0，接種量為 10%，發(fā)酵時(shí)間為48 h。

本研究中廢水COD去除率最高和單細(xì)胞蛋白生成量最高的發(fā)酵條件僅有發(fā)酵溫度存在差異。這可能是由于不同溫度下菌體利用的有機(jī)物和體內(nèi)的生理生化反應(yīng)存在差異的原因，如COD的去除與三羧酸生成量有關(guān)系，而單細(xì)胞蛋白的產(chǎn)生與糖酵解途徑有關(guān)［14］。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌與否對(duì)廢水處理效果的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌與否對(duì)廢水處理效果的影響見圖1。由圖1可見：發(fā)酵時(shí)間少于30 h時(shí)，未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基比滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率高；發(fā)酵時(shí)間超過(guò)36 h后，滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率高于未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率為75.75%，未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率為72.25%。這是因?yàn)槲礈缇陌l(fā)酵培養(yǎng)基中菌群組成復(fù)雜，熱帶假絲酵母雖然占有優(yōu)勢(shì)，但與其他菌種存在競(jìng)爭(zhēng)，共同消耗廢水中的有機(jī)小分子，因而在發(fā)酵反應(yīng)的前30 h其COD去除率比滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率高。發(fā)酵反應(yīng)超過(guò)30 h后，由于未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中部分種類的細(xì)菌生長(zhǎng)速度減慢，而且部分菌體出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，因而其COD去除率比滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率低。

由圖1還可見，發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的單細(xì)胞蛋白生成量為5.375 g/L，未滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的單細(xì)胞蛋白生成量為2.875 g/L。這是因?yàn)闇缇l(fā)酵培養(yǎng)基中菌種單一，有利于熱帶假絲酵母的生長(zhǎng)，故單細(xì)胞蛋白生成量較高。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌與否對(duì)廢水處理效果的影響

3 結(jié)論

a）采用熱帶假絲酵母處理苧麻生物脫膠廢水，將COD為23 060 mg/L的苧麻生物脫膠廢水稀釋1倍后進(jìn)行發(fā)酵處理，COD去除率最高，為60.85%；

b）發(fā)酵條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：發(fā)酵溫度為35 ℃、初始發(fā)酵pH為7.0、接種量為 10%、發(fā)酵時(shí)間為48 h的條件下，廢水COD去除率最高；發(fā)酵溫度為30 ℃、初始發(fā)酵pH為7.0、接種量為 10%、發(fā)酵時(shí)間為48 h的條件下，單細(xì)胞蛋白生成量最高。

c）發(fā)酵時(shí)間少于30 h時(shí)，未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基比滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率高；發(fā)酵時(shí)間超過(guò)36 h后，滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率高于未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率為75.75%，單細(xì)胞蛋白生成量為5.375 g/L；未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率為72.25%，單細(xì)胞蛋白生成量為2.875 g/L。

［1］ 郭雙慶，謝光銀. 苧麻纖維生物脫膠［J］. 廣西紡織科技，2009，38（6）：17 - 19.

［2］ 李宗道. 苧麻生理生化與遺傳育種［M］. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1989：82 - 97.

［3］ 龍芳年，袁力軍. 高效微生物凈化苧麻化學(xué)脫膠廢水的探討［J］. 中國(guó)麻業(yè)科學(xué)，2007，29（4）：204 -206.

［4］ 童柯，李翠蘭. 苧麻脫膠廢水預(yù)處理研究［J］. 資源開發(fā)與市場(chǎng)，2006，22（5）：409 - 410.

［5］ 丁紹敏，劉學(xué)軍，劉澤楨，等. 苧麻酶生化脫膠與應(yīng)用技術(shù)研究［J］. 廣西紡織科技，2006，35（2）：6 -10.

［6］ 陳進(jìn)，曾思蓉. 苧麻廢水處理工藝的探討［J］. 成都信息工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，21（4）：577 - 582.

［7］ 甄娜，何連芳，周景輝. 熱帶假絲酵母處理紅麻亞銨法制漿廢液的研究［J］. 造紙科學(xué)與技術(shù)，2007，26（2）：26 - 29.

［8］ 劉繼棟，付燦，王同陽(yáng). 熱帶假絲酵母在木薯淀粉酒精廢液治理中的應(yīng)用研究［J］. 中國(guó)釀造，2009，208：121 - 123.

［9］ 陳洪高，曾慶福，陳悟，等. 苧麻韌皮生物脫膠微生態(tài)系統(tǒng)的構(gòu)建方法：中國(guó)，10236673.1［P］. 2008-06-12.

［10］ 賴穎，閔偉紅，張大力，等. 利用木糖發(fā)酵高產(chǎn)酒精菌株的誘變育種和馴化研究［J］. 現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)信息，2009，19：350 - 352.

［11］ Kurtzman C P，Robnett C J. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit(26S) ribosomal DNA partial sequences［J］. Antom ie Leeuwenhoek，1998，73：331 - 371.

［12］ 北京化工研究院. GB/T 11914—1989水質(zhì) 化學(xué)需氧量的測(cè)定 重鉻酸鉀法［S］. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1989.

［13］ Devereux R，He Shaohua，Doyle C L，et al. Diversity and origin of Desulfovibro species ：Phylogenetic definition of a fam ily［J］. J Bacteriol，1990，172（7）：3609 - 3619.

［14］ Zhang Yongming，Bruce E R，Wang Jianlong，et al. High-carbohydrate wastewater treatment by IAL-CHS with immobilized Candida tropicalis［J］. Process Biochem，2005，40：857 - 863.

Production of Single Cell Protein from Ram ie Bio-degumm ing Wastewater Using Candida tropicalis

Wang Jun1，Hao Xinyan1，Yin Chaomin2，Cai Yin2，Zeng Qingfu1，Ruan Xinchao1

（1. Engineering Research Center for Cleaner Production of Textile Dying and Printing Under M inistry of Education，Wuhan Textile University，Wuhan Hubei 430073，China；2. School of Environmental Engineering，Wuhan Textile University，Wuhan Hubei 430073， China）

Ram ie bio-degumm ing wastewater was treated using Candida tropicalis. The wastewater with 23 060 mg/L of COD was diluted by 2 folds and treated by fermentation with the highest COD removal rate of 60.85%. The results of orthogonal experiments show that：Under the conditions of fermentation temperature 35 ℃，initial fermentation pH 7.0，inoculum dosage 10% and fermentation time 48 h，the COD removal rate is the highest；Under the conditions of fermentation temperature 30 ℃，initial fermentation pH 7.0，inoculum dosage 10% and fermentation time 48 h，the yield of single cell protein is the highest. When the fermentation time is 48 h，the COD removal rate and single cell protein yield with the sterilized fermentation medium are 75.75% and 5.375 g/L respectively，however，those with the unsterilized fermentation medium are 72.25% and 2.875 g/L respectively.

Candida tropicalis；ram ie；bio-degumm ing；fermentation；single cell protein；wastewater treatment

X703

A

1006-1878（2012）03 - 0255 - 05

2011 - 10 - 23；

2012 - 01 - 29。

王軍（1976—），男，山東省高唐縣人，博士，副教授，主要從事苧麻清潔生產(chǎn)方面的研究。電話027 - 87611776 ，電郵 Junwang@w tu.edu.cn。聯(lián)系人：阮新潮，電話 027 - 87611776 ，電郵 ruanxc72@163.com。

湖北省教育廳優(yōu)秀中青年科技人才項(xiàng)目（Q20 081704）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2010BAD02B00）。

（編輯 祖國(guó)紅）