漢坦病毒與機體干擾素免疫應答

葉偉 白文濤

漢坦病毒與機體干擾素免疫應答

葉偉 白文濤

漢坦病毒屬(hantavirus，HV)是布尼亞病毒科的單負鏈RNA病毒，其基因組分為L、M、S 3個片段，分別編碼病毒的RNA聚合酶(L)、包膜糖蛋白(Gn和Gc)和核衣殼蛋白(NP)，病毒主要分為引起腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)的舊大陸漢坦病毒和引起漢坦病毒心肺綜合征(hantavirus cardiopulmonary syndrome，HCPS)的新大陸漢坦病毒。前者主要包括漢坦病毒原型株漢坦病毒(HTNV)、漢城病毒(SEOV)、多布拉伐病毒(DOBV)和普馬拉病毒(PUUV)等，后者主要包括辛諾柏病毒(SNV)、紐約病毒(NY－1V)和安第斯山病毒(ANDV)等。除了這些病毒之外，還有被認為是不引起人類明顯疾病的圖拉病毒(TULV)和希望山病毒(PHV)等。

固有免疫是機體抵抗外來病原體入侵的第一道防線［1］。其中機體對病毒的識別是宿主產生免疫應答的先決條件病毒感染機體后，宿主通過一系列模式識別受體(pathogen recognition receptors，PRRs)來識別病毒的病原相關分子模式(pathogen－associated molecular patterns，PAMPs)從而引起干擾素(IFNs)等細胞因子的分泌，啟動下游效應分子來抑制病毒的復制。目前業已闡明，PRRs主要包括Toll－樣受體(Toll like receptor，TLRs)、視黃醛酸誘導基因I(RIG－I)樣RNA解旋酶(retinoic acid－inducible gene I－like RNA helicases，RLHs)和棒狀受體(NOD－like receptors，NLRs)等。同時，病原體在長期的進化過程中，也發展出了種類多樣的逃避宿主固有免疫的手段和方法來達到感染復制的目的。本文擬就漢坦病毒與固有免疫的干擾素系統之間的關系做一簡要綜述。

一、固有免疫的干擾素系統

IFNs是自分泌或旁分泌的具有多種功能的蛋白質。主要分為3種類型:Ⅰ型干擾素(IFNα，IFNβ)、Ⅱ型(IFNγ)和Ⅲ型(IFNλ1，IFNλ2和IFNλ3)。其中Ⅰ型與Ⅲ型IFNs可在機體絕大多數組織與細胞中產生，而Ⅱ型IFN主要由包括巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)和肥大細胞在內的多種免疫細胞產生［2，3］。IFN與細胞表面相應受體結合，激活Jak/Stat信號通路從而啟動三聚的IFN刺激應答因子(ISRE3)與信號傳遞和轉錄激活分子1(Stat1)、Stat2和IFN應答因子9(IRF9)。隨后ISRF3入核并結合位于大部分IFN誘導基因(ISGs)啟動子區域上特異的IFN刺激反應元件(ISRE)，從而發揮其免疫效應［4，5］。

RNA病毒具有眾多可被宿主PRRs所識別的PAMPs，TLR與RIG－I是目前已闡明的識別病毒PAMPs的受體。目前為止，包膜糖蛋白、dsRNA、5'端具有三磷酸的單鏈RNA、非甲基化的CpG DNA均被確定可與特異的PRRs反應［4］。PRRs參與識別后最終激活TNF受體相關因子3(TRAF3)、TRAF家族成員相關NF－κB激活蛋白結合激酶1(TBK1)和IκB－激酶ε(IKKε)等，并進而激活IRF3/IRF7［9］，最終引起下游干擾素基因的表達。

二、漢坦病毒與干擾素系統的相互作用

1．固有免疫識別漢坦病毒的機制:TRAF3已被證實參與了Ⅰ型和Ⅲ型干擾素的PRR信號通路［5］。A549細胞上TLR3正常表達水平比較低，IFN刺激后，A549并不能誘導抗病毒應答，而HTNV感染后的A549可以上調TLR3，使得TLR3下游抗病毒免疫應答成為可能［6］。TLR3主要表達在胞質的內體(endosome)中或細胞表面，通過其胞外區識別特異的PAMPs——dsRNA［7］。HTNV對TLR3的募集可導致抗病毒和炎癥應答。HTNV的持續感染很可能是固有免疫應答的滯后和炎癥反應的持續。此外，多種RNA病毒，例如流感病毒A、西尼羅河病毒、白蛉病毒等被發現可以通過TLR3來調節固有免疫的炎癥應答，使炎癥因子的表達增多。所以，TLR3的持續激活可能是炎癥因子過量表達的誘因，這也可能病毒致病的一個因素。

利用不含有RIG－I基因的HuH 7．5細胞實驗結果顯示，PHV誘導早期固有免疫應答并不依賴RIG－I［6］。但最近Günther Sch?nrich的研究第一次發現體外轉錄HTNV N RNA和HTNV N ORF(開放讀碼框)誘導了RIG－I信號，表明RIG－I可以識別漢坦病毒的復制［8］。但HTNV RNA激活RIG－I的機制尚不清楚，該研究組的研究也與前期研究相似，即HTNV基因組RNA并不顯著激活RIG－I［9］。而HTNV的cRNA是否是RIG－I的激活因子還需要進一步研究。

2．漢坦病毒對干擾素的誘導:體外漢坦病毒感染實驗和中和試驗已證實Ⅰ型干擾素(IFNα/β)是固有免疫應答的調節中心并可限制漢坦病毒的感染［10］。近期研究表明Ⅲ型干擾素和Ⅰ型干擾素參與了漢坦病毒在體內、體外誘導的固有抗病毒應答。PUUV感染的HFRS病人的急性期與恢復期血清相比，Ⅲ型干擾素水平有所降低。與PHV相比，在A549與HuH7細胞中，致病性的PUUV誘導了更低水平的IFNγ［11］。

致病性與非致病性漢坦病毒誘導固有免疫應答的機制在多種細胞系中是保守的。有的研究組報道在A549，HuH7中觀察到了HTNV、PHV和ANDV感染產生的抗病毒與炎癥應答，但也有研究報道稱這些細胞系對SNV感染沒有相關應答［11～13］。此外，敲除TRAF3與TLR3基因的A549細胞失去了對HTNV感染誘導黏病毒抗性蛋白A(MxA)的能力［6］。Vero E6細胞是Ⅰ型干擾素基因缺失的細胞系，早期觀點是Vero E6對病毒感染并不能產生固有免疫應答。但最近有報道稱，SNV、ANDV和PHV感染Vero E6后，可以檢測到Ⅲ型干擾素的分泌［13］。此外，據Prescott及其同事報道稱，由Vero E6擴增出的病毒儲存液會含有不同量的IFNλ，這是一個新的發現，但這也說明了用Vero E6擴增出的病毒所得出的實驗結論可能會有不同程度的偏差，或需要重新評價［13］。

mRNA表達水平分析顯示，原代內皮細胞在PHV感染后誘導了高水平的MxA。但在NY－1V與HTNV感染中未發現MxA水平升高。作者推測可能是這些漢坦病毒抑制了早期IFN的應答。類似的研究結果也在TULV和HTNV間發現。內皮細胞并不具有IFNλ的功能性受體，所以來源于Vero E6細胞的病毒一般不會影響內皮細胞的ISGs的表達［13］。

多個研究組研究顯示，重組Ⅰ型與Ⅱ型干擾素的預處理可有效抑制漢坦病毒的復制［14］。但感染若已經建立，則干擾素對病毒復制的干擾作用則顯著降低［10，15］。而其中的一個原因是，宿主細胞產生的高水平的病毒編碼的產物表達水平大大超過固有免疫系統效應分子所能處理的量。此外，重組的MxA預處理可以在Vero E6細胞中阻止漢坦病毒復制，但其機制尚不明了。其他病毒中，如正黏病毒科的Togoto病毒和與漢坦病毒同屬布尼亞病毒科的La Crosse病毒的核蛋白可與MxA相互作用，且這種相互作用被認為是MxA通過消除病毒復制所需的NP來起作用，類似的相互作用可能也在漢坦病毒感染的細胞中存在［16］。為逃避MxA的效應，一些漢坦病毒可使MxA失去功能［11］。體內與體外的研究提示除MxA外，其他IFN誘導的抗病毒效應分子也可能參與了控制漢坦病毒感染的過程［17］。上述研究都顯示，在病毒產物大量增多之前誘導出合適的固有免疫應答有利于控制病毒的感染。

3．漢坦病毒相關逃逸機制:為建立感染，病毒發展出了復雜和多重的策略來逃避或阻斷宿主的抗病毒IFN系統。目前的研究顯示ANDV、HTNV和PHV損害了與Ⅰ型干擾素激活的Stat1和Stat2。Stat1活化水平的降低并在胞質內的停滯也在外源表達ANDV的糖蛋白的細胞中觀察到［15，18］。但ANDV與PHV都對IFN的下游通路具有類似的拮抗作用，故單獨靶向激活Stat1/Stat2很難解釋致病與非致病漢坦病毒固有免疫應答水平的不同的原因［18］。

核轉錄因子NF－κB，是IFN的增強子復合體的一個成分，并且是IFN高水平表達的必要成分［19］。最近有研究發現HTNV的核蛋白可以抑制TNF－α誘導的NF－κB的活化。外源表達核蛋白(NP)即可以阻斷NF－κB p65亞基轉運入核。與此對應，有報道稱，NP與可控制蛋白穿越核孔的importin α蛋白有直接相互作用［20］。在SEOV、DOBV中也發現類似結果;而ANDV、SNV和PUUV中尚未見報道［21］。這些結果均表明了漢坦病毒發展出了多種規避固有免疫的策略。

PHV、PUUV和ANDV的基因組S片段還具有第2個開放讀碼框，可能編碼一個非結構蛋白。目前已發現PUUV感染的Vero E6中有NSs－ORF的表達。且報告基因實驗證實了PUUV的NSs－ORF可拮抗干擾素［22，23］。但NSs－ORF在致病性與非致病性漢坦病毒中都有發現，所以，NSs－ORF可能并不是漢坦病毒在人類中致病的決定因素。

Spiropoulou及其同事最早在1993年在美國四角區暴發的HCPS時分離出了HCPS的病原體。他們近期研究發現IRF3激活前，對ANDV和PHV感染的細胞有不同的影響［18］。與此相應，外源表達NY－1V的Gn胞質段尾部可以通過破壞TRAF3/TBK1復合體來阻斷IRF3的激活。這與感染實驗中發現TRAF3/TBK1的狀態不穩定的結果類似。但表達PHV Gn胞質尾段或和PHV感染實驗中均未發現TRAF3/TBK1復合體的分解［10，24］。

NY－1V Gn胞質尾段只有在蛋白酶抑制劑MG132存在時才可檢測到，而MG132存在時也增加了ANDV和HTNV Gn胞質區的穩定性。與此相對，PHV的Gn胞質尾段在MG132存在與否時未見顯著差別。此研究說明，致病性漢坦病毒的Gn可能是阻滯IFN應答的一個重要因素。但Gn胞質尾段可能并不是降低IFN應答的決定性因素。通過PHV和PUUV的體外基因重排，命名為PHPUV的病毒含有PUUV的M片段和PHV的S和L片段。這種表型的漢坦病毒與PUUV和PHV感染細胞實驗相比，所表現的IFN系統的應答(包括MxA和IFN mRNA)都與PHV類似而與PUUV相反［11］。這說明這兩種病毒對固有免疫應答的調節是由S與L片段決定的。早期研究表明非致病的PHV利用整合素β1而致病性PUUV利用β3作為受體而入胞的。這項實驗說明了M片段編碼的嚢膜糖蛋白在調節病毒特異的固有免疫應答上貢獻甚微。這項研究的另一意義是，PHPUV感染可產生針對PUUV的中和抗體，而病毒本身又類似PHV對人不致病，所以有可能作為一種減毒活疫苗來使用。但其他類型的重組可能會造成新的疾病流行，有報道稱Bunyamwera病毒與Batai病毒在體內的重組造成了嚴重的發熱病的暴發。所以體內重排的危險因素也是應用重組病毒所要認真考慮的問題。

三、總結與展望

漢坦病毒在其自然宿主中是終身隱性感染，故各種病毒都有規避宿主免疫應答的成熟策略。目前已經確定RIG－I可識別漢坦病毒的復制信號，漢坦病毒可在被感染細胞中募集TLR3，多種漢坦病毒可以逃避MxA途徑和抑制NF－κB啟動下游信號，且多種漢坦病毒的Gn胞質尾段可以阻斷IRF3的激活等等。鑒于固有免疫在機體抗病毒感染中的重要作用，明確漢坦病毒規避IFN系統的不同機制是確切闡明漢坦病毒致病機制的首先要解決的問題。

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(收稿:2011－11－15)

(修回:2011－11－18)

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國家自然科學基金資助項目(30972590，30970148)

710032西安，中國人民解放軍第四軍醫大學微生物學教研室(葉偉);610083中國人民解放軍成都軍區總醫院普通外科中心微創外科(白文濤)

白文濤，電子信箱:baiwtao@163．com