復方丹參生物學作用中MAPK信號轉導通路的研究進展

馬小燕 丁盛娣 朱雪瓊 謝愛蘭

復方丹參是我國傳統醫藥學中應用最早而且最廣泛的藥物之一，具有抑制血小板凝集、擴張血管、改善微循環、增加人體組織血流量、提高機體對缺氧的耐受性、糾正血液高凝狀態、保護心肌調節免疫功能等作用，臨床廣泛用于冠心病、高血壓、慢性心力衰竭等多種心血管疾病的治療［1］。自從20世紀30年代開始研究復方丹參的化學成分，至今已經有70多年的歷史，發現了50多種有效成分。復方丹參中的化學成分主要分為脂溶性的二萜醌類化合物和水溶性的酚酸類成分［2］，其中脂溶性成分包括丹參酮Ⅱ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮等等，而最主要的脂溶性成分為丹參酮ⅡA。另外，水溶性成分包括原兒茶醛、丹參素、丹酚酸A、紫草酸等。目前對復方丹參的化學成分已基本清楚，但對其藥理作用具體機制尚不清楚。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activatedprotein kinases，MAPK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于胞質內，可被多種環境刺激(細胞因子、生長因子、神經遞質、激素、細胞應激和細胞黏附等)活化成有生物學作用的磷酸化形式，一旦被激活可進入核內激活磷酸化核轉錄因子和其他蛋白激酶等多種底物，調節相關基因的表達，進而參與細胞生長、發育、分裂及細胞間的功能同步等多種生理過程。MAPK級聯反應包括:MAPK激酶激酶(MKKK)、MAPK激酶(MKK)、MAPK等3種激酶，構成了一個連續的激活途徑。1986年Sturgill等首次報道MAPK，后經研究證實MAPK信號轉導通路存在于從低等原核細胞到高等哺乳動物的大多數細胞內。迄今為止，在哺乳動物中已明確了5條MAPK途徑，即細胞外信號調節激酶1和2(ERK1/2)、c－Jun氨基末端激酶(JNK)、p38、ERK3/4和 ERK5亞家族，而其中對 ERK1/2、JNK、p38 的研究較為廣泛［3］，ERK1/2(extracellular signal regulated kinase1/2)是所有MAPKs家族成員中最早被發現，而且是最具特征性的，在所有亞家族中研究得最為透徹的一條MAPK信號轉導通路。ERK信號轉導通路的大致模式為:細胞外多種刺激→Ras→Raf→MEK1/2→ERK→細胞的有絲分裂、分化。c－Jun氨基末端激酶(c－Jun N－terminal kinase，JNK)是20世紀90年代初發現的一種蛋白激酶，到目前為止，JNK是可以有效的磷酸化c－Jun氨基末端的唯一的蛋白激酶，又叫應激激活蛋白激酶(stress activated protein kinase，SAPKs)，也是 MAPK 超家族成員之一，屬于保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。p38MAPK是1993年由國外學者在研究滲透壓對真菌的影響時發現的，其性質與JNK相似，也屬應激激活的蛋白激酶，參與炎癥、增殖、凋亡等多種生理過程。

一、MAPK信號轉導通路在復方丹參抗炎作用中的研究

復方丹參有明確的抗炎作用，其中發揮主要作用的成分是脂溶性成分，如丹參酮等，但是抗炎作用的具體機制尚未明確。近年來的研究發現復方丹參的抗炎作用與MAPK信號轉導通路有著密切的關系。有研究發現丹參酮能夠抑制鼠巨噬細胞株RAW264.7中脂多糖(LPS)誘導炎癥介質的釋放，如一氧化氮、腫瘤壞死因子－α，白介素－1β。為了進一步研究丹參酮抑制炎癥因子釋放的具體機制，隨后通過對鼠巨噬細胞株RAW264.7的體外培養來研究丹參酮在脂多糖(LPS)誘導細胞中炎癥因子釋放及磷酸化MAPK表達的影響［4］，發現丹參酮和 p38抑制劑(SB203580)、ERK1/2抑制劑(PD98059)及JNK抑制劑(SP600125)有著相似的作用，即可以通過抑制RAW 264.7細胞中 LPS誘導的 p38、ERK1/2及 JNK的磷酸化水平，減少炎癥介質的釋放，發揮其抗炎作用。最近，有文獻也證實了丹參酮能夠下調脂多糖誘導ERK1/2、p38及JNK的磷酸化，減少炎癥介質腫瘤壞死因子－α，白介素－6的釋放，從而抑制炎癥反應。Don等［5］的研究中，補體C5能誘導體外培養的巨噬細胞的遷移發生炎癥反應，丹參酮可以抑制巨噬細胞的遷移，進而發揮抗炎作用，同時MEK抑制劑(PD98059)和p38抑制劑(SB203580)也能夠抑制巨噬細胞的游走，但是JNK抑制劑SP600125卻不能，實驗還證明丹參酮可以明顯抑制補體C5誘導ERK1/2的磷酸化水平，然而p38和JNK的磷酸化水平卻并沒有受到影響。總之，目前的研究表明丹參酮可能通過抑制ERK1/2、p38或JNK的磷酸化，減少炎癥介質的釋放，從而發揮其抗炎作用。

二、MAPK信號轉導通路在復方丹參抗腫瘤作用中的研究

復方丹參中的丹參酮類成分有著廣泛的菲醌結構，是其細胞毒作用的物質基礎，通過產生自由基引起DNA損害，抑制腫瘤細胞DNA合成，從而發揮著對腫瘤細胞的殺傷作用。在肝癌的發生發展過程中，活性氧(reactive oxygen species，ROS)被認為是一個重要的內源性調節因子。Lee等［6］對隱丹參酮、二氫丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA誘導的人肝癌細胞株HepG2壞死的體外實驗中，發現4種復方丹參成分均可以誘導ROS的產生，促進p38的磷酸化。同時將p38抑制劑(SB203580)加入到4種復方丹參預處理過HepG2細胞中，結果發現細胞壞死受到抑制，表明ROS介導的p38激活在復方丹參誘導肝癌細胞株的壞死過程中發揮著重要作用。但是也有學者證實復方丹參能促進兩種結腸癌來源的細胞株HCT15和CO115壞死，進而發揮抗癌作用，進一步的實驗發現復方丹參能抑制HCT15細胞株中ERK1/2的磷酸化，并不改變CO115細胞株中ERK1/2的磷酸化水平，推測復方丹參可能部分通過MAPK/ERK1/2信號傳導通路促進細胞壞死來發揮其抗癌作用［7］。抗凋亡蛋白(Bcl－2)在前列腺癌細胞株(DU145)中有較高表達，對誘導壞死的蛋白Fas有較強的抑制效應，而隱丹參酮卻可以抑制Bcl－2的表達，進而增強前列腺癌細胞對Fas介導壞死的作用，進一步的實驗證實JNK和p38可以激活Fas誘導Bcl－2基因的表達，其抑制劑可以降低JNK和p38的活性，而隱丹參酮也可以抑制作用于Bcl－2上游的JNK和p38的活性，表明隱丹參酮間接的抗癌作用與JNK和p38有著較為密切的關系［8］。p46是JNK的一個亞型，與胰島素和TNF－α有著相似的性質，可以刺激細胞的增生。在肺腺癌細胞A549中丹參縮酚酸的一個中間產物 S－3－1(α2－ allyl－3，4－ dihydroxybenzaldehyde)可以抑制p46的表達，抑制腫瘤細胞的增殖，進而發揮抗腫瘤作用。

三、MAPK信號轉導通路在復方丹參細胞保護作用中的研究

Lu等［9］用10μmol/L丹參縮酚酸來研究過氧化氫誘導細胞壞死的保護作用機制，發現丹參和MEK抑制劑PD98059均能夠抑制過氧化氫誘導的骨髓細胞p－ERK1/2調作用，由此推測丹參縮酚酸對骨髓干細胞的保護作用是通過調節MEK/ERK1/2實現的。但是有學者在研究丹參縮酚酸對血小板聚集作用的影響實驗中，發現丹參縮酚酸和PI3K抑制劑LY294002和TGX－221有相似的作用，抑制Akt的磷酸化，卻不能抑制p38的活性，認為丹參縮酚酸可能是通過PI3K－Akt而不是通過MAPK信號轉導通路抗血小板聚集［10］。丹羅酚酸是臨床上治療阿爾茨海默病的傳統藥物，但是其具體藥理作用機制目前尚不清楚。Iuvone等［11］通過對阿爾茨海默病β－淀粉樣肽段(amyloid－beta peptide，AB)誘導的小鼠嗜鉻細胞瘤細胞的毒性實驗，發現羅丹酚酸能降低細胞的毒性，并用免疫印記方法對AB誘導后磷酸化的p38水平進行檢測，結果發現p38的磷酸化水平表達較對照組增加，羅丹酚酸卻能降低p38的磷酸化，濃度越大，抑制程度越強，推測羅丹酚酸的這一作用可能與其能夠抑制p38的磷酸化有關。Liu等［12］的研究發現丹參酮能減輕過氧化氫誘導的大鼠大腦微血管內皮細胞的壞死，并能夠抑制過氧化氫誘導的ERK1/2的磷酸化，另外實驗還發現MEK抑制劑U0126下調ERK1/2的磷酸化水平的同時，還可以減少細胞的壞死。已有研究表明膽汁酸誘導的肝細胞壞死在膽汁淤積性肝疾病中起著重要的作用。在原代培養的小鼠肝細胞的實驗中，富含丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮的PF2401－SF能夠對抗鵝脫氧甘膽酸誘導肝細胞壞死作用，而后者可以激活 JNK、p38及ERK1/2的磷酸化，PF2401－SF能夠抑制JNK和p38的磷酸化，但只有JNK抑制劑SP600125能夠抑制鵝脫氧甘膽酸誘導的肝細胞壞死，認為抑制JNK磷酸化可能是PF2401－SF抗細胞壞死的機制［13］。Au－Yeung等［14］研究復方丹參在脂蛋白誘導人臍帶靜脈內皮細胞的壞死的實驗中，發現脂蛋白能夠激活JNK及細胞凋亡蛋白酶(caspase－3)，并且能夠增加細胞色素C的釋放，而復方丹參可以通過下調JNK和細胞凋亡蛋白酶的活性，減少細胞色素C的釋放，從而減輕人臍帶靜脈內皮細胞的凋亡，推測復方丹參可能是通過抑制JNK信號轉導通路減少脂蛋白誘導的細胞壞死。

四、MAPK信號轉導通路在復方丹參抗增生肥大作用中的研究

相關的研究表明復方丹參抗增生肥大的作用也與MAPK有關。在研究丹參酮對胎牛血清誘導體外培養的血管平滑肌細胞增殖的影響時，發現胎牛血清誘導血管平滑肌細胞的同時可以上調ERK1/2的磷酸化，丹參酮卻可以抑制血管平滑肌細胞的增殖并下調磷酸化的ERK1/2，且表現出劑量依賴性，對總的ERK1/2影響沒有顯著意義，所以推測ERK1/2信號轉導通路參與丹參酮抑制血管平滑肌細胞增殖的作用。Cheng等［15］研究丹參縮酚酸(SAB)對小鼠肝星狀細胞增生作用的影響，采用MTT法發現SAB能夠抑制星狀細胞的增生，并表現出劑量依賴性，同時采用Western blotting法檢測，發現 SAB對磷酸化的ERK1/2的表達水平有明顯抑制作用，而對總的ERK1/2的表達無影響，推測丹參縮酚酸的抗增生作用可能與激活ERK1/2通路有著密切的聯系。在植物血凝素(PHA)誘導人外周血單核細胞的增殖研究實驗中，發現丹參酮A能夠抑制細胞的增殖作用，細胞活力實驗證實丹參酮的抑制作用并不是通過其對細胞的直接細胞毒性作用，而是可能與丹參酮A對ERK、p38和JNK的磷酸化的抑制作用有關。國內學者江鳳林［16］等通過新生大鼠心肌細胞體外培養來研究復方丹參的主要成分丹參酮ⅡA衍生物(丹參酮ⅡA磺酸鈉(sodium tanshinoneⅡA sulfonate，STS)對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的心肌細胞肥大及磷酸化細胞外信號調節激酶(ERK1/2)表達的影響，采用Western blotting方法檢測發現STS對p－ERK1/2蛋白表達具有抑制作用，并呈劑量依賴性。另外，實驗還發現STS能阻斷AngⅡ引起的ERK1/2活化，說明STS可以通過抑制ERK1/2活化、阻斷ERK1/2信號通路發揮抑制AngⅡ誘導心肌肥大反應的作用。已有研究證實丹參酮通過阻斷細胞周期、抑制ERK1/2的磷酸化及下調c－fos的表達顯著抑制血管平滑肌細胞增殖和內膜增殖［17］。另外復方丹參能夠通過抑制ERK1/2的磷酸化減少高半胱氨酸(Hcy)誘導的平滑肌細胞的增殖，從而用于治療心血管疾病。

五、MAPK信號轉導通路在復方丹參其他生物學作用中的研究

還有學者發現復方丹參其他的一些生物學作用也與MAPK信號轉導通路相關。由內皮細胞產生的纖溶酶原激活物抑制劑(PAI－1)在動脈粥樣硬化疾病的發病過程中起著重要作用。用體外培養的人臍帶靜脈內皮細胞來研究丹參縮酚酸對PAI－1的影響時發現丹參縮酚酸能夠抑制腫瘤壞死因子TNF－α誘導PAI－1的表達，而JNK抑制劑(SP600125)能夠增強丹參縮酚酸的抑制作用，推測丹參縮酚酸可能是通過抑制MAPK信號轉導通路對動脈粥樣硬化中PAI－1的起作用。有學者發現隱丹參酮抑制TNF－α誘導的人主動脈平滑肌細胞的轉移，后者參與動脈動脈粥樣硬化形成，采用Western blotting技術發現隱丹參酮還可以下調ERK1/2、JNK及p38的磷酸化。但是在Jin等的實驗中發現丹參酮能夠抑制人主動脈平滑肌細胞的轉移，并且可以抑制TNF－α誘導的ERK1/2的磷酸化，但對JNK和p38的磷酸化沒有影響。這些研究可能就是為復方丹參在臨床上用于治療冠心病提供了必要的理論基礎。有研究表明丹參酮不但能夠抑制破骨細胞的成熟和分化，還能夠減少成熟破骨細胞的骨吸收活性，進一步實驗還發現，破骨細胞中NF－κB受體激動劑(RANKL)能夠誘導ERK的磷酸化，丹參酮能夠下調ERK的磷酸化，同時也能夠抑制RANKL誘導p38磷酸化，而對RANKL誘導的JNK磷酸化沒有影響。Kim等［18］發現丹參酮ⅡA能夠通過增強 BMP－2誘導的堿性磷酸酶(ALP)的產生，后者標志著成骨細胞的分化，同時增加BMP－2 mRNA的表達，而實驗還發現p38的抑制劑(SB022190)能夠抑制丹參酮ⅡA誘導ALP的表達，而且能夠抑制丹參酮ⅡA誘導p38磷酸化表達。

綜上所述，目前的研究表明復方丹參的多種生物學作用與MAPK中ERK1/2、p38及JNK的關系較為密切，但是對于ERK3/4和ERK5亞家族與復方丹參的生物學作用的研究尚未見報道，相信在以后的研究中，MAPK信號轉導通路在復方丹參的相關研究機制中會更加透徹，從而為復方丹參的臨床應用提供必要的理論基礎，有利于進一步開發復方丹參在多種臨床疾病治療中的價值。

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