腸道急性移植物抗宿主病黏膜通透性與腸黏膜病理改變的相關性研究

蔡芳芳 莊 強 朱融和 梁 彬 俞 康 江松福

消化道是急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease，aGVHD)的重要靶器官，也是重要的aGVHD放大系統［1］。如何早期評估腸道功能屏障，早期阻斷這一始動環節，減少aGVHD的發生顯得至關重要。目前臨床上仍缺乏安全有效的檢測手段。本研究采用小鼠異基因骨髓移植模型，研究aGVHD腸道通透性及其嚴重程度的關系，旨在為早期腸道aGVHD提供較敏感的檢測指標。

材料與方法

1.aGVHD小鼠實驗模型［2］:SPF級雌性 BALB/C(H-2d)小鼠，6～8周齡，體重18～22g。實驗動物均購自溫州醫學院，許可證號:SYXK(浙)2005-0061。隨機分為單純照射組(對照組)和aGVHD移植后第7、11和15天組，每組8只。TBI組接受直線加速器全身照射(總劑量:8.0Gy，照射距離:50cm，照射時間:8min，劑量率:1.0Gy/min)。對照組只接受TBI照射，與實驗組同步喂養。

2.儀器:直線加速器(VARIAN CL2300C/D，美國);美國Agilent 1100高效液相色譜系統;美國 Agilent INTERFACE 35900E信號轉換器;法國SEDERE SEDEX75蒸發光散色檢測器;NH2色譜柱(Agilent，美國);7500 Real Time PCR System(ABI公司，美國);臺式高速離心機 (BECKMAN公司，美國)。

3.試劑:乳果糖標準品和甘露醇標準品(色譜純，Sigma公司);乙腈(色譜純，Fisher Scientific公司);異丙醇(色譜純，天津四友試劑公司);甲醇(分析純，天津四友試劑公司);超純水(Millipore公司，法國)。

4.給藥方法及尿樣采集:受試前所有小鼠禁食8～12h，取0.5ml乳果糖/甘露醇混合液(含乳果糖60mg/ml，甘露醇40mg/ml)，用灌胃器插小鼠食管上端緩慢灌注。收集6h尿液，記總量，將尿樣置于-20℃保存，待尿樣收齊后檢測。分別采集對照組小鼠和aGVHD后第7、11和15天小鼠的6h尿液。

5.尿樣預處理:取冰凍貯存的尿液樣品解凍、搖勻，將尿樣離心(12000r/min)30min，以去除尿中的沉淀物。再經0.22μm濾膜去蛋白顆粒。用超聲波脫氣20min后上機分析待檢。

6.色譜條件參考文獻［3］的方法:色譜柱:Agilent NH2色譜柱(4.6mm×250mm×5um)，柱溫為30℃，流動相為乙腈:水(83∶17)，流速為 1.0ml/min，進樣量為 20μl，ELSD 檢測器漂移管溫度:40℃;載氣壓力:3.0bar;電信號放大系數:4。

7.腸組織病理改變及評分標準:光鏡下觀察組織學變化，評價小腸aGVHD程度，并進行相關性分析。小腸aGVHD嚴重程度按Thomas GVHD病理組織學分級標準判定［4］。0度(0分):腸黏膜絨毛正常。Ⅰ度(1分):腸黏膜隱窩腺體擴張，個別上皮細胞壞死。Ⅱ度(2分):同Ⅰ度，腸腺壞死脫落。Ⅲ度(3分):同Ⅱ度，灶性黏膜裸露。Ⅳ度(4分):彌漫性黏膜裸露。每個時間點選取清晰的切片8張，每張切片于光鏡下(×400)隨機取5個視野，由有經驗的病理科醫師進行盲法評分。

結 果

1.腸道通透性比較:腸道通透性以乳果糖和甘露醇排出率的比值(L/M)表示。腸道aGVHD后7、11和15天組尿中乳果糖和甘露醇排出率的比值(L/M)均明顯高于對照組，分別為0.509±0.353，0.717±0.012，0.762 ±0.014，0.291 ±0.053，差異有統計學意義(P＜0.05)，并隨著時間的延長，L/M比值逐漸增高。

2.移植后腸道組織病理變化及aGVHD嚴重程度評分:異基因移植組根據存活期、外周血白細胞計數、臨床表現及病理檢查等均可在相對集中的時間內(8～15天)觀察到典型的aGVHD改變。第7、11天可見腸道病理GVHDⅠ～Ⅱ度改變，腸黏膜上皮細胞輕中度壞死脫落，黏膜下有少量淋巴細胞浸潤。第11～15天可見腸道病理GVHDⅡ～Ⅲ度改變，黏膜上皮壞死脫落，黏膜下層充血水腫，黏膜下層與固有層有較多淋巴細胞浸潤，隱窩細胞有變性壞死，腺體有淋巴細胞浸潤;皮膚可見散在的炎細胞;肺泡壁可見充血、滲出、淋巴細胞浸潤。未見明顯的Ⅳ度改變。移植后第7天，即發現腸道黏膜上皮細胞有輕度壞死脫落，黏膜下有少量淋巴細胞浸潤，移植后第11天腸道黏膜損傷程度進一步加重，腸道aGVHD呈上升趨勢，第15天時損傷達到最重，腸道aGVHD嚴重程度評分大幅度上升。aGVHD后7、11和15天組aGVHD嚴重程度評分較對照組顯著增加(P＜0.05)，分別為0.810±0.259，1.940 ±0.176，2.750 ±0.267，0.000±0.000。

3.aGVHD各組L/M與腸道aGVHD嚴重程度相關性分析:經 Spearman分析，尿 L/M比值與腸道aGVHD嚴重程度呈顯著正相關(r=0.903，P＜0.01)。隨著腸道通透性的增加，腸道aGVHD嚴重程度越重。

討 論

減少嚴重GVHD發生和降低移植相關死亡的關鍵在于預防GVHD的發生。消化道是aGVHD重要的靶器官之一，腸道屏障功能障礙、腸內細菌及內毒素移位是導致腸道aGVHD的一個重要因素，嚴重影響了HSCT的預后［5，6］。由于腸黏膜通透性變化可準確反映腸屏障功能狀態，對預示疾病過程中轉歸具有主要意義［7，8］。所以，臨床上對 aGVHD 患者如能進行腸道通透性監測，將對減少腸源性感染的發生并及早采取防治對策，降低病死率有十分重要的作用。

腸黏膜屏障主要由腸黏膜上皮細胞和細胞間緊密連接構成。以乳果糖和甘露醇作為探針能夠檢測腸通透性的改變。通常情況下，甘露醇分子質量小，可經跨膜途徑以簡單擴散的方式被動吸收，而乳果糖分子質量大，不能穿過泡膜和細胞間緊密連接，只有極少量被吸收，當腸黏膜受損時，高分子乳果糖則可通過細胞膜旁徑路被大量吸收，使L/M比值增加，故測定尿中L/M比值可間接準確地反映腸通透性改變，廣泛用于腸黏膜通透性的評估，而通透性改變則可反映腸黏膜的損害程度［9］。莊強等［3］采用 HPLC-ELSD檢測小鼠尿液中乳果糖和甘露醇含量，具有簡便、專一靈敏、重復性好、準確可靠等特點，可用于aGVHD小鼠腸道通透性的測定和監測。本研究通過建立 aGVHD小鼠模型，采用 HPLC-ELSD檢測aGVHD組尿乳果糖和甘露醇的排出量，結果發現aGVHD后各組L/M值較對照組增加，且隨著時間的延長而不斷增加，與文獻［10］報道一致。

研究結果表明，腸道aGVHD后腸黏膜結構遭到嚴重破壞，導致腸黏膜屏障功能減弱，使細菌的降解產物如 LPS進入血液，引發“細胞因子風暴”，是aGVHD致靶器官各種病理損害的重要原因之一［5，6］。本研究通過對腸道通透性與腸道aGVHD嚴重程度相關性分析結果表明，aGVHD后腸黏膜通透性與腸道aGVHD嚴重程度呈顯著相關性，即腸道通透性增加，腸道aGVHD嚴重程度越重。這一結果提示，腸道通透性與腸道損傷程度有著密切的關系。aGVHD引起腸道黏膜細胞損傷、黏膜通透性增加。

檢測尿中L/M比值變化方法簡單易行，為無創傷指標，克服了常規通過胃腸鏡活檢判斷aGVHD腸道病變嚴重程度的缺陷，能動態反映腸黏膜屏障功能狀況，在腸道aGVHD的評估中具有臨床應用價值。它及時在早期發現并判斷腸屏障的受損程度，為降低aGVHD的發生率和病死率提供了有力的無創指標。

1 Johansson JE，Ekman T.Gut toxicity during hemopoietic stem cell transplantation may predict acute graft-versus-host disease severity in patients［J］.Dig Dis Sci，2007，52(9):2340-2345

2 蔡芳芳，俞康，江松福.小鼠異基因骨髓移植急性移植物抗宿主病模型的建立［J］.溫州醫學院報，2009，39(4):320-324

3 莊強，俞康，江松福.全身照射小鼠模型腸道通透性HPLC-ELSD檢測方法的建立［J］.溫州醫學院報，2010，40(3):224-228

4 何長民，石炳毅.器官移植免疫學［M］.北京:人民軍醫出版社，1995:351-368

5 Ferrara JL，Reddy P.Pathophysiology of graft-versus-host disease［J］.Semin Hematol，2006，43(1):3-10

6 Copelan EA.Hematopoietic stem-cell transplantation［J］.N Engl J Med，2006，354(17):1813-1826

7 Fink MP.Gastrointestinal muosal injury in experimental model of shock，trauma and spesis［J］.Crit Care Med，1991，19(5):627-641

8 Lunn PG，Northrop-Clewes CA，Downes RM.Intestinal permeability，mucosal，and growth fatering in Gambian infants［J］.Lancet，1991，338(8772):907-910

9 Dumas F，Aussel C，Pernet P，et al.Gas chromatograply applied to the lactulose2mannitol intestinal permeability test［J］.J Chromatogr B，1994，654(2):276-281

10 Melichar B，Hyspler R，Dragounová E，et al.Gastrointestinal permeability in ovarian cancer and breast cancer patients treated with paclitaxel and platinum［J］.BMC Cancer，2007，7:155