代謝組學及其在阿爾茨海默病研究中的應用

劉秀勤 王德才 (哈爾濱醫科大學公共衛生學院，黑龍江 哈爾濱 150081)

代謝組學〔1〕是通過考察生物體系(細胞、組織或生物體)受刺激或擾動后(如將某個特定的基因變異或環境變化后)代謝產物圖譜及其動態變化，研究生物體系的代謝網絡的一種技術，是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后發展起來的一門新興“組學”。與其他三種組學研究的DNA、RNA和蛋白質等生物大分子不同，代謝組學是對生物體系中的小分子化合物進行定性定量研究。近年來，代謝組學相關技術發展迅速，已廣泛應用到毒理學〔2〕、營養學〔3〕、植物學〔4〕、微生物學〔5〕、藥物研發〔6〕、疾病研究〔7〕、功能基因組學〔8〕等領域。阿爾茨海默病(AD)是一種原因不明的以進行性認知功能障礙和記憶損害為特征的中樞神經系統退行性疾病，典型病理改變為老年斑和神經纖維纏結的形成。AD病因復雜，其發病機制至今仍然不明。近年來，一些學者〔9〕對AD的生物學指標進行了研究，希望能夠找到早期診斷AD的標志物并探明其發病機制。代謝組學運用高通量、高敏感的分析技術，結合化學計量學方法，分析體液中的代謝產物，可以將所有代謝物的信息整合到一起，通過比較其代謝特性，尋找出早期敏感的生物標志物，能夠幫助分析病變過程和輔助臨床診斷。本文就代謝組學及其在AD生物標志物研究中的現狀做一綜述。

1 代謝組學的研究概況

代謝組學多應用在藥物研發和疾病研究等領域研究動物體液或組織。Fiehn等〔1〕將其定義為對限定條件下的特定生物樣品中所有代謝產物的定性定量分析，多應用于植物和微生物領域研究細胞的代謝組學。代謝組學技術能夠將基因和蛋白質表達的微小變化在代謝物上放大，從而使檢測更為容易。根據研究對象和研究目的的不同，Fiehn〔10〕將代謝組學分為代謝物靶標分析、代謝輪廓分析、代謝組學及代謝物指紋分析等四個層次，研究的樣品主要包括尿液、血液、唾液以及細胞或組織的提取液等。代謝組學的研究一般包括樣品的采集和制備、代謝組數據的采集、數據預處理、多變量數據分析、標志物識別和途徑分析等步驟〔11〕。

1.1 樣品的采集及制備 在采集樣品之前，就要設計好樣本的采集時間、種類、部位、樣本量和采集樣品的器材等，并且采集樣品時要有嚴格的質量控制，盡可能在相同的條件下采集樣本，使實驗誤差減到最小。代謝產物的變化會影響分析結果，處理樣品時應抑制殘留酶的活性，避免發生氧化，采用冰凍、液氮降溫或冷凍干燥技術保存樣品〔12〕。根據研究目的和分析技術的不同，樣品預處理的方法也各不相同。磁共振(NMR)分析技術對樣品的處理比較簡單，控制樣品的pH值、選用不同的緩沖液即可〔13〕。氣相色譜質譜(GC-MS)技術需對揮發性較小的化合物進行衍生化，以增加其揮發性，擴大化合物的檢測范圍〔13〕。高效液相色譜質譜(HPLC-MS)聯用技術通常根據樣品的性質以及相似相溶原理，利用水和有機溶劑(甲醇、己烷等)分別提取，從而把非極性和極性物質分開〔14〕。由于特定的提取條件只適于某類化合物，目前尚無一種普適性的提取方法，故應根據不同的化合物選擇不同的預處理方法制備樣品。

1.2 代謝組學數據的采集 樣本預處理后，應選擇適當的分析方法檢測其中的代謝產物，進行代謝組數據的采集。目前多種分析技術〔15〕(色譜、質譜、NMR、電化學、毛細管電泳等)已經應用到代謝組學的研究中，表1比較了代謝組學研究中常用分析技術的各自優勢和適用范圍。其中色譜-質譜方法兼備色譜的高分離度、高通量及質譜的普適性、高靈敏度和特異性，1HNMR對含氫的代謝產物具有普適性，因此，色譜-質譜聯用技術和NMR技術是目前代謝組學研究中最主要的分析工具〔16〕。

表1 代謝組學研究中常用分析技術的比較

1.3 代謝組學數據的分析 由分析儀器獲得的元數據經適當的預處理〔21〕(包括濾噪、峰檢測、峰匹配、標準化、歸一化和重疊峰解析等)得到大量的多維的數據信息，需進一步借助化學計量學方法對代謝物進行全面分析。最常用的是模式識別技術，包括非監督學習方法和有監督學習方法。非監督學習方法〔16〕主要用于從原始譜圖信息或預處理后的信息中對樣品進行分類，不需相關樣品分類的任何背景信息，并將獲得的分類信息與樣本的原始信息進行比較，建立代謝產物與這些原始信息的聯系，篩選出相關的標記物，考察其代謝途徑，主要包括主成分分析(PCA)〔22〕、聚類分析(CA)〔23〕、非線性映射(NLM)〔24〕等。有監督學習方法〔16〕主要用于類別間的分類，使各類樣品間達到最大的分離，并利用建立的多參數模型對未知的樣本進行預測。主要包括神經網絡(NN)〔25〕、偏最小二乘法(PLS)〔26〕、偏最小二乘法-判別式分析(PLS-DA)〔27〕等。其中PCA和PLSDA是代謝組學研究中最常用的模式識別方法，這兩種方法通常以得分圖獲得對樣品分類的信息，載荷圖獲得對分類有貢獻變量及其貢獻大小，從而用于發現可作為生物標記物的變量〔16〕。代謝組學分析還需要各種代謝途徑和生物化學數據庫，數據庫中每種代謝產物都有其相應的化學、臨床、分子生物學和生化數據〔16〕。檢索相關代謝組學數據庫，同時結合醫學生物學相關理論，向代謝終點的上游追溯，能夠探索出生物標志物的代謝途徑或通路，進而了解疾病的發病機制。一些生化數據庫〔28〕如連接圖數據庫 (Connections Map DB)、京都基因與基因組百科全書 (KEGG)、METLIN、I-RIS、AraCyc、PathDB、生物化學途徑(ExPASy)、Duke博士植物化學和民族植物學數據庫、Arizona大學天然產物數據庫等，可供未知代謝物的結構鑒定或用于已知代謝物的生物功能解釋〔11〕。包含生物體代謝物組信息以及代謝物定量數據較多的數據庫有人類代謝組數據庫、ChemSpider數據庫，但目前尚無功能完備的數據庫。

2 AD概述

2009年AD國際組織發布目前全世界有3 500多萬癡呆癥患者，未來患者人數將每20年翻一番。國際上，將老年期癡呆分為AD、血管性癡呆和混合性癡呆等，其中60% ～80%為AD患者〔29〕。AD典型病理改變為大腦皮層及腦區的纖維蛋白沉積，即細胞外間隙的β淀粉樣蛋白(Aβ)和細胞內多聚Tau蛋白的沉積，兩者在病理形態學上分別表現為老年斑和神經纖維纏結。AD是一種中樞神經退行性疾病，發病機制尚不清楚，但是有多種學說〔30〕，如基因突變和多態性學說、膽堿能假說、tau蛋白學說、Aβ沉積假說、應激適應性衰竭假說、自由基損害假說、炎癥機制假說等。

AD起病隱匿，進展緩慢，逐漸表現出記憶力下降、認知功能損害、精神行為異常等癥狀，當出現明顯癡呆癥狀時臨床診斷沒有太大困難，但此時病情已無法逆轉，失去了治療時機。AD在發病早期一些分子靶標的改變早于其病理改變，更早于臨床癥狀的出現〔31〕，為此，國內外研究者采用不同的檢測方法和技術〔32〕對AD可能的生物標志物進行了大量的研究，但是到目前為止，還沒有找到一種可靠的、特異的、早期敏感的AD生物標志物，對其進行早期診斷。生物學標志物存在于腦脊液、血液和尿液等標本中，其中腦脊液直接和中樞神經系統的細胞外間隙相連，腦內生物學的變化會在腦脊液中反映出來〔33〕。許多學者研究了腦脊液內可能的標志物，主要集中在Aβ、總Tau蛋白(T-Tau)和磷酸化Tau蛋白(P-Tau)，檢測手段多為酶聯免疫吸附試驗和蛋白組學技術〔34〕，運用代謝組學技術來探索AD生物標志物的研究還不多。

3 代謝組學在AD標志物篩選中的應用

代謝組學在臨床疾病中的應用主要包括生物標志物的發現、疾病的診斷、治療和預后判斷〔35〕，但其最廣泛的應用是發現與疾病診斷和治療相關的代謝標志物〔16〕。代謝組學從機體的動態代謝途徑尋找標志物，將基因和蛋白質表達的微小變化在代謝物上放大，檢測患者體內所有的小分子代謝產物，從而使檢測更為容易。生物標志物是疾病預防和診斷的基礎，這提示可以尋找更多的標志物達到早期診斷和早期治療的目的。近年來，隨著代謝組學的出現和發展，一些學者嘗試運用代謝組學技術尋找能夠早期診斷AD的生物學標志物(表2)，希望在AD發生的早期診斷出該病，加以及時的治療和干預。

表2 代謝組學分析技術在AD生物標志物篩選中的應用

4 展望

代謝組學尚處于初始階段，其分析技術還不完善，目前還未找到一致的、早期的、敏感的、特異性強的生物標志物來預測和診斷AD。今后需進一步發展代謝組學的各種分析技術，采用多種聯合技術，通過多個角度、多個層次，篩選并解析所有的譜峰，從整體上研究機體代謝的全部過程及代謝組分，尋找高靈敏和特異的AD生物標志物。近年來，對AD患者尿液代謝組學的研究幾乎是一片空白，利用代謝組學新的研究方法，對尿液全組分進行分析，尋找AD早期標志物也是其發展方向。

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