乙酰肝素酶和血管內皮生長因子C mRNA的表達與肺癌侵襲和轉移的分子生物學

蘇樹偉 田 輝 李 林 岳韋名 高 存 司立博 (山東省交通醫院胸外科，山東 濟南 25003)

肺癌的侵襲和轉移是導致肺癌病人死亡的主要因素。乙酰肝素酶(HPSE)和血管內皮生長因子(VEGF)-C mRNA的表達是否與肺癌的侵襲性生長和淋巴結轉移有關，尚未見文獻報道。本研究同時采用RT-PCR法檢測了65例肺癌組織、癌旁組織和正常肺組織中HPSE和VEGF-C mRNA的表達，以探討HPSE和VEGF-C mRNA的表達與肺癌侵襲和轉移的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 所有病例均來源于山東大學齊魯醫院胸外科2006年9月至2007年7月間經臨床病理確診的65例肺癌病人，患者術前均未行放、化療。其中男性51例，女性14例，年齡41～76歲，中位年齡61歲。病程1～12個月，平均3.6個月。鱗癌31例(47.7%)，腺癌25例(28.5%)，大細胞癌3例(4.6%)，小細胞癌6例(9.2%)。高分化癌17例(26.2%)，中分化癌23例(35.4%)，低分化癌16例(24.6%)，未分化癌9例(13.8%)。65例患者無住院期間死亡，術后隨訪至2002年12月;實訪61例，失訪4例，隨訪率93.8%。

1.2 標本的采集和保存 全部標本均在手術中收集，取材后速凍于液氮中，-80℃超低溫貯存備用。腫瘤組織均在原發灶取材，避開壞死、炎癥區域;癌旁組織取自相應腫瘤旁2 cm;非癌組織(遠癌肺組織或正常肺組織)取自距腫瘤邊緣5 cm以上之肺組織，并經病理學檢查未見癌細胞。

1.3 RT-PCR法檢測HPSE mRNA 以TRIzol試劑(Gibco公司)提取總RNA，具體操作按廠家推薦步驟進行。提取后以紫外分光光度計(Bio-Rad公司)測定其純度(A260/A280≥1.8)并定量，在1%甲醛變性凝膠上電泳驗證RNA完整性。半定量RTPCR檢測HPSE mRNA表達，采用一步法試劑盒(Katara公司)中的廠家推薦步驟進行，擴增體積50 μl。以持家基因GAPDH擴增產量為內參照，對樣品模板用量標準化。HPSE和GAPDH分兩管進行擴增。引物序列參照文獻〔1〕設計:HPSE上游引物:5'-TTCGATCCCAAGAAGAAGGAATCAAC-3'，下游引物:5'-GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC-3';GAPDH上游引物:5'-TCCTGCACCACCAACTGCTT-3'，下游引物:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。RT-PCR條件參考文獻〔1〕并稍加優化:50℃ 逆轉錄30 min，94℃變性 45 s，60℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，28 個循環;72℃充分延伸5 min。擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，以Fluor-S多功能成像系統(Bio-Rad公司)掃描并拍照。

1.4 RT-PCR法檢測 VEGF-C mRNA總RNA提取試劑，逆轉錄試劑盒，VEGF-C的 RT-PCR特異引物序列由Life Technologies公司合成，片段長度183 bp。上游引物:5'-TGTACAAGTGTCAGCTAAGG-3';下游引物:5'-CCACATCTATACACACCTCC-3'。β-actin 片段長度 268 bp，上游引物:5'-CAACTTCATCCACGTTGACC-3'，下游引物:5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3'。PCR 循環參數:94℃，1 min;55℃，90 s;72℃，90 s。循環 30次，在72℃延伸10 min。以試劑盒提供之對照RNA樣品及其特異性引物的擴增產物為陽性對照，以反應系統中不加模板RNA的擴增產物為陰性對照，以β-actin為內對照。PCR產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線燈下觀察，與Markers對比堿基對大小，以出現明顯與目的基因堿基相同的區帶為陽性〔2〕。

1.5 統計學處理 計量資料采用方差分析及t檢驗，多計量資料之間的關系比較用多元線性回歸分析，應用SPSS12.0軟件進行統計學分析。

2 結果

2.1 HPSE和VEGF-C mRNA在正常肺組織、癌旁組織和肺癌組織中的表達 RT-PCR結果顯示，肺癌組織中HPSE和VEGFC mRNA陽性表達率(55.4%、61.5%)明顯高于癌旁組織和正常肺組織(12.3%、15.4%;3.1%、4.6%，P ＜0.05)，見圖1，圖2。

2.2 HPSE和VEGF-C mRNA表達與肺癌組織類型、分化程度、分期及預后 不同類型和不同分化程度肺癌組織中HPSE和VEGF-C mRNA的陽性表達率比較無顯著差異(P＜0.05);Ⅲ期和Ⅳ期肺癌組織中HPSE和VEGF-C mRNA陽性表達率明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期(P＜0.05);生存3年以下肺癌HPSE和VEGF-C mRNA陽性表達率明顯高于生存3年以上者(P＜0.05)，圖3、圖4和見表1。

圖1 ODC mRNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜(HPSE)

圖2 ODC mRNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜(VEGF-C)

圖3 HPSE基因mRNA表達

圖4 VEGF-C基因mRNA表達

表1 HPSE mRNA、VEGF-C mRNA陽性表達與肺癌組織類型、分化程度、分期及預后〔n(%)〕

3 討論

侵襲和轉移是惡性腫瘤的重要特征，也是影響腫瘤患者治愈率的主要因素。HPSE可在數個位點上降解硫酸乙酰肝素，破壞細胞外基質和基底膜的完整性，從而有利于腫瘤細胞穿越細胞外基質和血管壁，促進其侵襲和轉移;同時還有利于血管內皮細胞的遷移和生長，促進新生血管的形成〔3～5〕。VEGF-C是唯一可與內皮細胞膜上的VEGFR-3(Flt4)結合并特異性促進淋巴管生長的因子，當其與受體Flt-4結合后，可促進腫瘤淋巴管內皮細胞的遷移和增殖〔6～9〕。本研究提示HPSE mRNA表達在肺癌的生長、侵襲和轉移以及血管生成中發揮著作用，HPSE參與了肺癌組織的血管形成和肺癌細胞的擴散轉移。VEGF-C是促進腫瘤經淋巴轉移的重要因素，因此可以推測肺癌細胞分泌VEGF-C，可能通過激活支氣管壁淋巴管內皮細胞膜上的VEGFR-3引起腫瘤周圍淋巴管增生，或誘導腫瘤內淋巴管形成，從而使腫瘤細胞通過淋巴管進行轉移和擴散;由此可見，肺癌的生長、侵襲和轉移可能是HPSE促微血管生成和VEGF-C促淋巴管生成協同作用所致。

本研究結果提示HPSE和VEGF-C mRNA在促進肺癌侵襲和轉移中可能具有普遍意義。HPSE和VEGF-C mRNA高表達的腫瘤細胞侵襲和轉移的能力強，HPSE和VEGF-C mRNA在促進腫瘤細胞穿越血管壁、實行擴散和轉移中發揮著作用，結果提示HPSE和VEGF-C mRNA可作為判斷肺癌生物學行為和患者預后的一個參考指標。

1 Watanabe M，Aoki Y，Kase H，et al.Heparanase expression and angiogenesis in endometrial cancer〔J〕.Gynecol Obstet Invest，2003;56(2):77-82.

2 Vlodavsky I，Friedmann Y，Elkin M，et al.Mammalian heparanase:gene cloning，expression and function in tumor progression and metastasis〔J〕.Nat Med，1999;5(7):793-802.

3 Assal N，Yamanoi A，Ono T，Set al.The clinicopathologicalsignificance of heparanase and basic fibroblast growth factor expressions in hepatocellular carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res，2001;7(5):1299-305.

4 Vlodavsky I，Elkin M，Pappo O，et al.Mammalian heparanase as mediator of tumor metastasis and angiogenesis〔J〕.Isr Med Assoc J，2000;2(Suppl):37-45.

5 Ikuta M，Podyma KA，Maruyama K.Expression of heparanase in oral cancer cell lines and oral cancer tissues〔J〕.Oral Oncol，2001;37(2):177-84.

6 Kirkin V，Mazitschek R，Krishnan J，et al.Characterization of indolinones which preferentially inhibit VEGF-C and VEGF-D-induced activation of VEGFR-3 rather than VEGFR-2〔J〕.Eur J Biochem，2001;268(21):5530-40.

7 Kamsda K，Oike Y，Takakura N，et alS.VEGF-C signaling pathways through VEGFR-3 in vasculoangiogenesis and hematopoiesis〔J〕.Blood，2000;96(12):3793-800.

8 Witte D，Thomas A，Ali N，et al.Expression of the vascular endothelial growth factor receptor-3(VEGFR-3)and its ligand VEGF-C in human colorectal adenocarcinoma〔J〕.Anticarcinoma Res，2002;22(3):1463-6.

9 Fitzpatrik TE，Lash GE，Yanaihara A，et al.Inhibition of breast carcinoma and trophoblast cell invasiveness by vascular endothelial growth factor〔J〕.Exp Cell Res，2003;283(2):247-55.