藏藥余甘子中三種酚酸類成分的HPLC含量測定研究

冀靜，楊繼家，廖琦，潘正，張藝

余甘子為大戟科Euphorbiaceae葉下珠屬Phyllanthus植物余甘子Phyllanthus emblica L.的成熟果實[1]。余甘子是一味重要的傳統民族藥，在我國約有16個民族使用，以漢族和藏族尤為習用[2]。藏醫主要用來治療血熱血瘀，培根病，赤巴病，高血壓病等。現代研究表明[3～4]余甘子具有很好的抗氧化能力和氧自由基清除作用，其抗氧化活性成分主要為多酚類、黃酮類以及維生素C。

余甘子的質量控制方法目前主要有HPLC法測定余甘子中沒食子酸、槲皮素、單寧酸、各種氨基酸的含量[5～10]，分光光度法測定總黃酮和多糖含量[11～12]，但同時測定其多酚類抗氧化活性成分[13]如沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸等的含量卻未見報道。對于含有余甘子藥材的經典復方制劑三果湯散，已有文獻則多采用高效液相色譜法對其沒食子酸等單一成分進行含量測定，專屬性較差。本項研究建立了HPLC同時測定余甘子中3個主要成分沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸（圖1）的方法，為余甘子的質量控制提供科學依據。

圖1 余甘子中3個多酚類成分結構式

1 儀器與試藥

日本島津公司LC-2010A HT型高效液相色譜儀及島津公司LCsolution色譜工作站；BSA-124D電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司）；KQ3200E型超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；UPTI-10T 型超純水機（上海優普實業有限公司）；ZDHW型調溫電熱套（北京中興偉業儀器有限公司）。

乙腈為色譜純（Fisher Scientific），水為實驗室自制超純水，其余試劑均為分析純；沒食子酸（批號110831-200302，含量測定用）和柯里拉京（批號111623-200302，含量測定用）對照品購于中國藥品生物制品檢定所，鞣花酸（實驗室自制，HPLC測試純度大于98.5%）。

余甘子藥材5批，分別來自西藏藏醫學院標本館、西藏山南藏醫院、西藏自治區藏藥廠、云南、成都荷花池藥材市場，各藥材批次見表1（各批次藥材經成都中醫藥大學民族醫藥學院張藝研究員鑒定為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblica L. 的果實）。

表1 藥材來源批次表

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate LP RP-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脫，0～10min，5%～10%A；10～15min，10%～13%A；15～20min，13%～15%A；20～30min，15%～17%A；30～40min，17%～22%A；40～45min，22%～25%A。流速0.8mLmin-1；檢測波長220nm；柱溫25℃；進樣量10μL。對照品溶液和樣品溶液的色譜圖見圖2。

圖2 A為混合對照品色譜圖，B為余甘子供試品色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸、柯里拉京對照品適量，加80%甲醇溶解配制成濃度為0.13mg/mL，0.11mg/mL的對照品溶液；精密稱取鞣花酸對照品適量，加甲醇溶解配制成濃度為0.11mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

余甘子供試品溶液的制備：精密稱取余甘子藥材粉末（過60目篩）0.1g，精密加入80%甲醇60mL，稱定重量，回流提取45min，放冷，80%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45μm微孔濾膜，即得余甘子供試品溶液。

2.4 線性關系考察

精密量取沒食子酸對照品溶液0.5mL，1mL，1.5mL，2mL，2.5mL，柯里拉京對照品溶液0.5mL，1mL，1.5mL，2mL，2.5mL，分別置于10mL容量瓶中，加80%甲醇定容至10mL，搖勻；再精密吸取鞣花酸對照品溶液0.5mL，1mL，1.5mL，2mL，2.5mL，加甲醇定容至10mL，搖勻。按上述色譜條件，分別進樣10μL，記錄色譜峰面積，以峰面積Y為縱坐標，質量濃度X（g L-1）為橫坐標，進行線性回歸，見表2。

表2 各對照品組分的回歸方程、相關系數及線性范圍（n=6）

沒食子酸標準曲線圖

圖3 各對照品標準曲線圖

2.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液10μL，連續進樣6次，以沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸色譜峰峰面積計，測定值的RSD分別為0.42%，0.44%，0.6%。

2.6 穩定性試驗

精密吸取余甘子供試品溶液按照2.1項下的色譜條件，每次進樣10μL，分別于制備后0，2，4，6，8，10，12h測定峰面積，分別測定沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸色譜峰峰面積，其RSD值分別為0.8%、0.5%、0.4%，表明樣品溶液在12h內基本穩定。

2.7 重復性試驗

分別取同一批余甘子藥材6份，按照2.3項下方法分別制備余甘子供試品溶液，然后按2.1項下的色譜條件進行測定，每次進樣10μL，分別測定峰面積，結果沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸的RSD值分別為1.6%，1.7%，0.74%。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量樣品6份，精密稱定。然后分別精密加入一定量的對照品，按照2.3項下方法制備樣品溶液，按2.1項下的色譜條件進行測定，計算加樣回收率。沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸的平均回收率分別為98.22%，97.53%，101.49%，RSD分別為1.14%，1.11%，1.40%。

2.9 樣品的測定

分別取不同來源余甘子藥材，按2.3項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下的色譜條件進行測定，進樣量10μL，采用外標兩點法以峰面積計算3種成分的含量，見表3。

表3 不同來源余甘子藥材中3種檢測成分的質量分數（%）

3 討論

3.1 檢測波長的確定

分別考察了220nm，270nm，280nm三種檢測波長，結果表明沒食子酸和鞣花酸在三種波長下均有較好的吸收，考慮到余甘子中柯里拉京含量相對較低，且在220nm檢測波長下其能夠達到最大吸收，故最終選擇220nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

分別考察了相關文獻[14～15]條件和本文采用的乙腈-0.1%磷酸水溶液洗脫條件，結果表明本文采用的梯度洗脫系統效果較佳，化合物間分離效果好，基線平穩，分析時間適中。

3.3 柱溫的選擇

比較了25℃，30℃和35℃柱溫條件，結果顯示在25℃條件下，樣品的分離效果較好。

3.4 提取方法的選擇

考察了超聲提取和回流提取30min、45min、60min，結果表明回流提取效果明顯優于超聲提取，且提取時間45min和60min效果相當，故最終選用45min作為提取時間。

3.5 含量測定結果分析

從樣品的三個成分含量測定結果可以看出，柯里拉京的含量相對較低，購于成都荷花池藥材市場余甘子藥材的含量最低，可能與存放時間過長、儲存方式不當等因素有關。

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