實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在人類細(xì)小病毒B19檢測中的應(yīng)用

上海浩源生物科技有限公司 疏 翠 安 順

人類微小病毒B19（Human parvovirus B19，HPV B19）是兒科常見的出疹性疾病——傳染性紅斑（又稱第五病，Erythema infection，EI）的病因。除了這一輕型自限性感染外，B19 病毒還可使慢性溶血病病人發(fā)生再障危象及急性多關(guān)節(jié)病。在免疫缺損病人中可造成持續(xù)性感染。由于細(xì)小病毒B19致病的廣泛性和復(fù)雜性，目前國際上對該病毒的研究比較活躍。B19 可通過呼吸道傳播，也可通過輸血和使用血液制品傳播，從而引起多種疾病。B19病毒的近期感染主要通過IgM抗體的檢測，常用捕獲法或放射免疫測定，IgG 抗體對診斷急性感染無意義，其存在僅表明曾感染過，主要用于血清流行病學(xué)調(diào)查。目前實(shí)驗(yàn)室和臨床檢測中，最敏感檢測病毒的方法是PCR法，通過對B19進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，能突破窗口期的局限性，更利于B19 病毒的早期診斷和治療。本文，筆者根據(jù)熒光定量PCR的原理建立了人類細(xì)小病毒B19的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，經(jīng)過對臨床樣本的檢測，顯示建立的方法敏感性高，特異性好，適合B19病毒的篩查和核酸定量檢測。

一、材料與方法

1.標(biāo)本來源。WHO B19 標(biāo)準(zhǔn)品購自英國國家生物制品檢定所（NIBSC）。單純皰疹病毒樣本、巨細(xì)胞病毒樣本、帶狀皰疹病毒樣本、T細(xì)胞白血病病毒樣本、腺病毒樣本、呼吸道合胞病毒樣本、流感病毒樣本和副流感病毒樣本來自上海地區(qū)醫(yī)院。89份臨床樣本為血液中心獻(xiàn)血員血漿留樣中篩檢到的B19陽性樣本。

2.試劑和儀器。DNA 提取采用上海浩源磁珠提取試劑盒，dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dUTP、dTTP）和Tris 為宏錦公司采購，尿嘧啶糖基化酶（UNG）為roche 公司產(chǎn)品、熱啟動(dòng)TaqDNA 聚合酶購自Fermentas 公司。pMD18-T 試劑盒試劑盒購自Takara。DNA1000 微流芯片試劑盒購自Agilent。artus? Parvo B19 RG PCR Kit 購自QIAGEN 公司。實(shí)驗(yàn)儀器為TBG Ezbeads-system32 核酸提取儀、Agilent Stratagene 安捷倫Mx3000P 熒光定量PCR儀和Agilent Caliper 2100微流芯片儀。

3.引物探針的設(shè)計(jì)及合成。從NCBI 上下載B19 核苷酸序列，運(yùn)用計(jì)算機(jī)DNAMAN、Oligo、Primer 5 軟件自行設(shè)計(jì)引物和探針。B19 引物在結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2 均有保守序列，但是VP1較好，選取PA57634BR/1995 上VP1 保守序列為檢測片段，設(shè)計(jì)引物和探針：上游引物5’-GGGCCAAT TGGAGGTATTAAATC-3’，下游引物5’-CCACCGTCCTGTAGCTTTACG-3’，探針5’-Fam-TA CT A CCTTAGTTCAGTATGCTGTG-BHQ1-3’。擴(kuò)增片段長度為117bp。

4.樣本B19 DNA的提取。采用上海浩源磁珠提取試劑盒提取純化樣本中的B19 DNA，樣本用量200 uL，提取過程在TBG Ezbeads-system 32核酸提取儀上自動(dòng)化進(jìn)行。操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

5.實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體積為60 μL，其中模板為20 μL，熱啟動(dòng)Taq酶為2U，尿DNA糖基化酶（UNG）0.2U，1×PCR 緩沖液，引物各為30 pmol，探針為15 pmol，200 μmol/LdNTP，5.0 mmol/L MgCl2。反應(yīng)條件為：37 ℃UNG 酶反應(yīng)2 min；50℃UNG 酶滅活5 min；94 ℃預(yù)變性10 min；（94 ℃變性10 s；55 ℃退火35 s；65 ℃延伸35 s）×45個(gè)循環(huán)；熒光信號(hào)層設(shè)定為FAM熒光素，熒光信號(hào)采集設(shè)定在最后一步的65 ℃。PCR 過程在Agilent Stratagene 安捷倫Mx3000P 熒光定量PCR儀上進(jìn)行。

6.PCR 產(chǎn)物的鑒定。將PCR 產(chǎn)物用Agilent Caliper 2100 微流芯片儀進(jìn)行檢測，分析產(chǎn)物片段的大小。然后再將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳，然后將包含目的核酸片段大小的瓊脂糖切膠后用磁珠法進(jìn)行純化，將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物測定濃度后，用Takara的pMD18-T試劑盒將其與載體pMD18-T物質(zhì)的量之比3:1 的比例在T4 連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-VP1。用CaCl2 化學(xué)轉(zhuǎn)化pMD18-T-VP1 至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，用藍(lán)白斑篩選陽性轉(zhuǎn)化菌，提取重組質(zhì)粒，酶切，選擇陽性克隆菌進(jìn)行測序。

7.定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。將提取的陽性重組質(zhì)粒用Qiagen公司的B19核酸定量檢測試劑盒進(jìn)行標(biāo)定。將B19 WHO標(biāo)準(zhǔn)品（5×105IU）加水500 uL溶解，得到1×106IU/mL，然后用PBS稀釋成1×106IU/mL、1×105IU/mL、1×104IU/mL、1×103IU/mL共4個(gè)梯度，用WHO標(biāo)準(zhǔn)品用Qiagen公司的B19核酸定量檢測試劑盒共同檢測稀釋好的B19標(biāo)準(zhǔn)品和B19陽性質(zhì)粒，以WHO標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)定得到B19 陽性質(zhì)粒的濃度。標(biāo)定好的質(zhì)粒用PBS稀釋到1×107IU/mL、1×106IU/mL、1×105IU/mL、1×104IU/mL、1×103IU/mL 共5 個(gè)梯度，用建立的檢測體系進(jìn)行提取擴(kuò)增作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

8.特異性檢測。采用磁珠提取試劑盒提取單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、帶狀皰疹病毒、T細(xì)胞白血病病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒和副流感病毒樣本中的病毒核酸，用建立的PCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增檢測。

9.靈敏度檢測。將B19病毒的WHO標(biāo)準(zhǔn)品用用正常人血清稀釋到250 IU/mL、100 IU/mL、50 IU/mL、25 IU/mL、10 IU/mL，然后用建立的熒光PCR病毒核酸檢測系統(tǒng)對每個(gè)濃度梯度分別檢測30次，檢測結(jié)果用PROBIT進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定檢測體系的分析靈敏度。

10.臨床樣本的檢測。將研制的B19核酸定量檢測系統(tǒng)與美國QIAGEN 公司的artus?Parvo B19 RG PCR Kit 共同對89 份臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，通過數(shù)據(jù)分析，比較兩個(gè)檢測系統(tǒng)的相關(guān)性。

二、結(jié)果

1.PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物微流芯片結(jié)果。B19 感染血液樣本DNA 經(jīng)核酸提取和PCR 擴(kuò)增后，采用Agilent Caliper 2100 微流芯片儀進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段大小約為117bp，與設(shè)計(jì)的目的片段大小一致，檢測結(jié)果如圖1所示。

圖1 B19PC R 產(chǎn)物微流芯片檢測結(jié)果

2.重組質(zhì)粒pMD18-T-VP1 測序結(jié)果。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物克隆測序后，blast分析顯示序列和GENEBANK的同源性達(dá)93%～100%。

3.定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。用B19WHO標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定好的質(zhì)粒用PBS 稀釋到1×107IU/mL、1×106IU/mL、1×105IU/mL、1×104IU/mL、1×103IU/mL、用建立的檢測體系進(jìn)行提取擴(kuò)增，在結(jié)果分析中把對應(yīng)的孔類型設(shè)定為standard，然后把對應(yīng)的核酸含量填寫進(jìn)去，分析后軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.161*LOG（X）+40.60，相關(guān)系數(shù)RSq=1.000，擴(kuò)增效率Eff.=107.2%，如圖2所示。

圖2 B19陽性質(zhì)粒建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線

4.特異性檢測。用磁珠提取試劑提取皰疹病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒和副流感病毒樣本的核酸，PCR系統(tǒng)擴(kuò)增模板，結(jié)果只有B19樣本樣本有擴(kuò)增曲線，其他樣本均為產(chǎn)生擴(kuò)增曲線。

5.靈敏度檢測。將B19病毒的WHO標(biāo)準(zhǔn)品用正常人血清稀釋到250 IU/mL、100 IU/mL、50 IU/mL、25 IU/mL、10 IU/mL，每份樣本取200 uL，用磁珠提取試劑盒進(jìn)行核酸提取，取提取的模板40 uL，采用PCR 系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示系統(tǒng)靈敏度可以到49.16 IU/mL。見表1。

6.臨床樣本的檢測。將研制的B19 核酸定量檢測系統(tǒng)與美國QIAGEN公司的artus? Parvo B19 RG PCR Kit共同對89份臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，通過數(shù)據(jù)分析，得出兩個(gè)檢測系統(tǒng)所得數(shù)值具有顯著相關(guān)性。相關(guān)方程為FQ=1.0285×QIAGEN+0.42（n=89），r=0.9785，P〈0.001，結(jié)果如圖3所示。

表1 B19病毒分析靈敏度檢測結(jié)果

圖3 B19核酸定量檢測系統(tǒng)與Q IA G EN公司產(chǎn)品臨床檢測相關(guān)性

三、討論

B19 病毒為單鏈DNA 病毒。目前，多采用血清學(xué)B19 抗體和抗原的檢測，但是檢測B19病毒抗體起初是采用血源抗原，但該抗原來源困難，難于普及和推廣。熒光定量PCR，因采用熒光標(biāo)記的探針雜交或直接使用能和雙鏈DNA 結(jié)合的熒光素檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)一步提高了檢測的敏感性和特異性。

由于B19具有高度保守性，本文，筆者選擇其基因組高度保守區(qū)域?yàn)閿U(kuò)增靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針，對提取后獲得的模板進(jìn)行B19 DNA 擴(kuò)增。擴(kuò)增過程中Taq DNA 聚合酶5’-3’外切酶活性切割反應(yīng)系統(tǒng)中帶熒光標(biāo)記的TaqMan探針，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號(hào)不斷積累。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀通過檢測達(dá)到和超過熒光閾值的信號(hào)給出樣品的陰陽性結(jié)果。由圖2可以看出，不同梯度定量模板數(shù)的對數(shù)值與CT值之間具有很好的相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)為1。同時(shí)，建立的檢測方法采用了含有UNG-dUTP 抗污染系統(tǒng)，UNG 酶特異識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物中U-DNA片段中的UTP的位點(diǎn)并進(jìn)行切割，從而有效防止了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。

對于B19核酸的提取純化筆者采用了近年迅速發(fā)展且被廣泛應(yīng)用的磁珠法核酸提取。磁珠是以納米級(jí)磁性材料（如三氧化二鐵、四氧化三鐵、鐵鈷合金等）為載體，外面包裹高分子骨架材料并經(jīng)各種不同的物理化學(xué)方法處理后制備成磁性微球，該磁性微球可以在高鹽環(huán)境下實(shí)現(xiàn)對核酸分子的吸附，而在低鹽環(huán)境下又可以方便地把吸附的核酸釋放到緩沖液中。

通過對B19病毒W(wǎng)HO國際標(biāo)準(zhǔn)品的檢測，建立的方法的分析靈敏度達(dá)到了49.16 IU/mL，同時(shí)檢測系統(tǒng)與相關(guān)病毒樣本無交叉反應(yīng)，特異性良好。與美國QIAGEN 公司的artus? Parvo B19 RG PCR Kit共同檢測臨床樣本，結(jié)果顯示兩種方法有很好的相關(guān)性。