實時熒光定量PCR技術在人類細小病毒B19檢測中的應用

上海浩源生物科技有限公司 疏 翠 安 順

人類微小病毒B19（Human parvovirus B19，HPV B19）是兒科常見的出疹性疾病——傳染性紅斑（又稱第五病，Erythema infection，EI）的病因。除了這一輕型自限性感染外，B19 病毒還可使慢性溶血病病人發生再障危象及急性多關節病。在免疫缺損病人中可造成持續性感染。由于細小病毒B19致病的廣泛性和復雜性，目前國際上對該病毒的研究比較活躍。B19 可通過呼吸道傳播，也可通過輸血和使用血液制品傳播，從而引起多種疾病。B19病毒的近期感染主要通過IgM抗體的檢測，常用捕獲法或放射免疫測定，IgG 抗體對診斷急性感染無意義，其存在僅表明曾感染過，主要用于血清流行病學調查。目前實驗室和臨床檢測中，最敏感檢測病毒的方法是PCR法，通過對B19進行實時熒光定量PCR檢測，能突破窗口期的局限性，更利于B19 病毒的早期診斷和治療。本文，筆者根據熒光定量PCR的原理建立了人類細小病毒B19的實時熒光定量PCR檢測方法，經過對臨床樣本的檢測，顯示建立的方法敏感性高，特異性好，適合B19病毒的篩查和核酸定量檢測。

一、材料與方法

1.標本來源。WHO B19 標準品購自英國國家生物制品檢定所（NIBSC）。單純皰疹病毒樣本、巨細胞病毒樣本、帶狀皰疹病毒樣本、T細胞白血病病毒樣本、腺病毒樣本、呼吸道合胞病毒樣本、流感病毒樣本和副流感病毒樣本來自上海地區醫院。89份臨床樣本為血液中心獻血員血漿留樣中篩檢到的B19陽性樣本。

2.試劑和儀器。DNA 提取采用上海浩源磁珠提取試劑盒，dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dUTP、dTTP）和Tris 為宏錦公司采購，尿嘧啶糖基化酶（UNG）為roche 公司產品、熱啟動TaqDNA 聚合酶購自Fermentas 公司。pMD18-T 試劑盒試劑盒購自Takara。DNA1000 微流芯片試劑盒購自Agilent。artus? Parvo B19 RG PCR Kit 購自QIAGEN 公司。實驗儀器為TBG Ezbeads-system32 核酸提取儀、Agilent Stratagene 安捷倫Mx3000P 熒光定量PCR儀和Agilent Caliper 2100微流芯片儀。

3.引物探針的設計及合成。從NCBI 上下載B19 核苷酸序列，運用計算機DNAMAN、Oligo、Primer 5 軟件自行設計引物和探針。B19 引物在結構蛋白VP1、VP2 均有保守序列，但是VP1較好，選取PA57634BR/1995 上VP1 保守序列為檢測片段，設計引物和探針：上游引物5’-GGGCCAAT TGGAGGTATTAAATC-3’，下游引物5’-CCACCGTCCTGTAGCTTTACG-3’，探針5’-Fam-TA CT A CCTTAGTTCAGTATGCTGTG-BHQ1-3’。擴增片段長度為117bp。

4.樣本B19 DNA的提取。采用上海浩源磁珠提取試劑盒提取純化樣本中的B19 DNA，樣本用量200 uL，提取過程在TBG Ezbeads-system 32核酸提取儀上自動化進行。操作嚴格按照說明書進行。

5.實時熒光PCR擴增檢測。實時熒光PCR擴增總反應體積為60 μL，其中模板為20 μL，熱啟動Taq酶為2U，尿DNA糖基化酶（UNG）0.2U，1×PCR 緩沖液，引物各為30 pmol，探針為15 pmol，200 μmol/LdNTP，5.0 mmol/L MgCl2。反應條件為：37 ℃UNG 酶反應2 min；50℃UNG 酶滅活5 min；94 ℃預變性10 min；（94 ℃變性10 s；55 ℃退火35 s；65 ℃延伸35 s）×45個循環；熒光信號層設定為FAM熒光素，熒光信號采集設定在最后一步的65 ℃。PCR 過程在Agilent Stratagene 安捷倫Mx3000P 熒光定量PCR儀上進行。

6.PCR 產物的鑒定。將PCR 產物用Agilent Caliper 2100 微流芯片儀進行檢測，分析產物片段的大小。然后再將PCR 產物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳，然后將包含目的核酸片段大小的瓊脂糖切膠后用磁珠法進行純化，將純化后的擴增產物測定濃度后，用Takara的pMD18-T試劑盒將其與載體pMD18-T物質的量之比3:1 的比例在T4 連接酶的作用下進行連接反應，構建重組質粒pMD18-T-VP1。用CaCl2 化學轉化pMD18-T-VP1 至大腸桿菌JM109感受態細胞中，用藍白斑篩選陽性轉化菌，提取重組質粒，酶切，選擇陽性克隆菌進行測序。

7.定量標準曲線的建立。將提取的陽性重組質粒用Qiagen公司的B19核酸定量檢測試劑盒進行標定。將B19 WHO標準品（5×105IU）加水500 uL溶解，得到1×106IU/mL，然后用PBS稀釋成1×106IU/mL、1×105IU/mL、1×104IU/mL、1×103IU/mL共4個梯度，用WHO標準品用Qiagen公司的B19核酸定量檢測試劑盒共同檢測稀釋好的B19標準品和B19陽性質粒，以WHO標準品作為標準曲線標定得到B19 陽性質粒的濃度。標定好的質粒用PBS稀釋到1×107IU/mL、1×106IU/mL、1×105IU/mL、1×104IU/mL、1×103IU/mL 共5 個梯度，用建立的檢測體系進行提取擴增作為標準曲線。

8.特異性檢測。采用磁珠提取試劑盒提取單純皰疹病毒、巨細胞病毒、帶狀皰疹病毒、T細胞白血病病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒和副流感病毒樣本中的病毒核酸，用建立的PCR系統進行擴增檢測。

9.靈敏度檢測。將B19病毒的WHO標準品用用正常人血清稀釋到250 IU/mL、100 IU/mL、50 IU/mL、25 IU/mL、10 IU/mL，然后用建立的熒光PCR病毒核酸檢測系統對每個濃度梯度分別檢測30次，檢測結果用PROBIT進行統計分析，確定檢測體系的分析靈敏度。

10.臨床樣本的檢測。將研制的B19核酸定量檢測系統與美國QIAGEN 公司的artus?Parvo B19 RG PCR Kit 共同對89 份臨床標本進行檢測，通過數據分析，比較兩個檢測系統的相關性。

二、結果

1.PCR 擴增產物微流芯片結果。B19 感染血液樣本DNA 經核酸提取和PCR 擴增后，采用Agilent Caliper 2100 微流芯片儀進行檢測，結果顯示擴增片段大小約為117bp，與設計的目的片段大小一致，檢測結果如圖1所示。

圖1 B19PC R 產物微流芯片檢測結果

2.重組質粒pMD18-T-VP1 測序結果。將擴增得到的PCR產物克隆測序后，blast分析顯示序列和GENEBANK的同源性達93%～100%。

3.定量標準曲線的建立。用B19WHO標準品標定好的質粒用PBS 稀釋到1×107IU/mL、1×106IU/mL、1×105IU/mL、1×104IU/mL、1×103IU/mL、用建立的檢測體系進行提取擴增，在結果分析中把對應的孔類型設定為standard，然后把對應的核酸含量填寫進去，分析后軟件自動生成標準曲線，標準曲線方程為Y=-3.161*LOG（X）+40.60，相關系數RSq=1.000，擴增效率Eff.=107.2%，如圖2所示。

圖2 B19陽性質粒建立的標準曲線

4.特異性檢測。用磁珠提取試劑提取皰疹病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒和副流感病毒樣本的核酸，PCR系統擴增模板，結果只有B19樣本樣本有擴增曲線，其他樣本均為產生擴增曲線。

5.靈敏度檢測。將B19病毒的WHO標準品用正常人血清稀釋到250 IU/mL、100 IU/mL、50 IU/mL、25 IU/mL、10 IU/mL，每份樣本取200 uL，用磁珠提取試劑盒進行核酸提取，取提取的模板40 uL，采用PCR 系統進行擴增，結果顯示系統靈敏度可以到49.16 IU/mL。見表1。

6.臨床樣本的檢測。將研制的B19 核酸定量檢測系統與美國QIAGEN公司的artus? Parvo B19 RG PCR Kit共同對89份臨床標本進行檢測，通過數據分析，得出兩個檢測系統所得數值具有顯著相關性。相關方程為FQ=1.0285×QIAGEN+0.42（n=89），r=0.9785，P〈0.001，結果如圖3所示。

表1 B19病毒分析靈敏度檢測結果

圖3 B19核酸定量檢測系統與Q IA G EN公司產品臨床檢測相關性

三、討論

B19 病毒為單鏈DNA 病毒。目前，多采用血清學B19 抗體和抗原的檢測，但是檢測B19病毒抗體起初是采用血源抗原，但該抗原來源困難，難于普及和推廣。熒光定量PCR，因采用熒光標記的探針雜交或直接使用能和雙鏈DNA 結合的熒光素檢測PCR擴增產物，進一步提高了檢測的敏感性和特異性。

由于B19具有高度保守性，本文，筆者選擇其基因組高度保守區域為擴增靶區域，設計特異性引物和熒光探針，對提取后獲得的模板進行B19 DNA 擴增。擴增過程中Taq DNA 聚合酶5’-3’外切酶活性切割反應系統中帶熒光標記的TaqMan探針，隨著PCR反應的進行，熒光信號不斷積累。實時熒光定量PCR儀通過檢測達到和超過熒光閾值的信號給出樣品的陰陽性結果。由圖2可以看出，不同梯度定量模板數的對數值與CT值之間具有很好的相關性，其相關系數為1。同時，建立的檢測方法采用了含有UNG-dUTP 抗污染系統，UNG 酶特異識別擴增產物中U-DNA片段中的UTP的位點并進行切割，從而有效防止了PCR擴增產物的污染。

對于B19核酸的提取純化筆者采用了近年迅速發展且被廣泛應用的磁珠法核酸提取。磁珠是以納米級磁性材料（如三氧化二鐵、四氧化三鐵、鐵鈷合金等）為載體，外面包裹高分子骨架材料并經各種不同的物理化學方法處理后制備成磁性微球，該磁性微球可以在高鹽環境下實現對核酸分子的吸附，而在低鹽環境下又可以方便地把吸附的核酸釋放到緩沖液中。

通過對B19病毒WHO國際標準品的檢測，建立的方法的分析靈敏度達到了49.16 IU/mL，同時檢測系統與相關病毒樣本無交叉反應，特異性良好。與美國QIAGEN 公司的artus? Parvo B19 RG PCR Kit共同檢測臨床樣本，結果顯示兩種方法有很好的相關性。