信號轉導轉錄激活因子3抑制劑WP1066對肝細胞肝癌生物學特性影響的研究

張巨波 郭坤 陳漪 葛寧靈 任正剛

（復旦大學附屬中山醫院肝腫瘤內科，上海 200032）

信號轉導轉錄激活因子3抑制劑WP1066對肝細胞肝癌生物學特性影響的研究

張巨波 郭坤 陳漪 葛寧靈 任正剛

（復旦大學附屬中山醫院肝腫瘤內科，上海 200032）

目的:探討信號轉導轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的抑制劑 WP1066在體外對人肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）增殖、侵襲能力的影響以及在體內應用時對HCC的抑制效果。方法:采用蛋白印跡、Transwell等方法檢測在不同惡性潛能的人HCC細胞株中STAT3總蛋白及磷酸化水平的差異，觀察應用WP1066后人HCC細胞株MHCC－97 H的增殖以及侵襲能力的改變。皮下接種MHCC－97 H細胞株建立裸鼠的HCC模型后，觀察WP1066對腫瘤生長的影響。結果:STAT3磷酸化水平在惡性潛能高的人HCC細胞株中顯著高于惡性潛能低的HCC細胞株；WP1066能顯著抑制MHCC－97H的增殖和侵襲。在裸鼠HCC模型中，WP1066能有效地抑制HCC生長。結論:WP1066能抑制STAT3磷酸化水平而有效抑制HCC增殖和侵襲。

肝癌； 抑制劑； 信號轉導轉錄激活因子3； 增殖； 侵襲

原發性肝癌居世界惡性腫瘤死因第3位，居我國惡性腫瘤死因第2位。在我國，該病的主要類型是肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC），占原發性肝癌的90%以上［1］。信號轉導轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在細胞因子和生長因子信號通路中發揮重要作用［2］。STAT3激活可影響細胞的增殖、凋亡和轉移等，可上調血管內皮生長因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）的表達，它也是反映腫瘤預后的標志［3］。STAT3作為一個潛在的治療靶點受到了廣泛的關注［4］。本研究旨在探討STAT3抑制劑WP1066對人HCC生物學特性的影響及其在體內對HCC生長的抑制作用。

1 資料與方法

1.1 細胞株

人HCC細胞株Hep3B、Hep G2購自美國標準生物收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），人HCC細胞株 MHCC－97L和MHCC－97 H由復旦大學肝癌研究所建立并保存。

1.2 細胞培養

Hep3B用含10%熱滅活胎牛血清的MEM培養基培養，Hep G2、MHCC－97L和 MH－CC－97H用含10%熱滅活胎牛血清的DMEM培養基培養，細胞生長至80%密度時用0.125%胰蛋白酶消化并傳代。MEM、DMEM培養液和特級胎牛血清均由Gibco公司生產。

1.3 蛋白印跡 按常規方法進行。

1.4 細胞增殖實驗

將對數生長期MHCC－97H細胞以5×104個/m L密度接種于96孔板（100μL/孔），WP1066按0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、6.0μmol/L分別給藥，以0.9%氯化鈉液干預的設為對照組，每組設4個副孔。連續培養72 h后，每孔加入20μL甲基四氮唑鹽（methyl tetrazolium salt，MTS），并于37℃、5%CO2培養箱內孵育90 min。用酶標儀（波長490 nm）測量吸光值。

1.5 細胞侵襲實驗

在 WP1066干預48 h后的MHCC－97 H細胞中，取5×104個細胞，加入鋪有基底膜基質膠（basement membrane matrix，Matrigel）的Transwell上室，使總體積為100μL，在下室加入600μL條件培養液后于37℃、5%CO2的條件下培養24 h。取出Transwell小室，甲醛固定，結晶紫染色。在200倍光學顯微鏡下隨機選擇5個視野，計數每個視野穿膜細胞數目，取其平均值。

1.6 酶 聯 免 疫 吸 附 試 驗 （enzyme－linked immu－nosorbent assay，ELISA）

人VEGF－ELISA試劑盒購自R＆D公司，按試劑說明書方法檢測，測定結果用酶標儀（主波長450 nm，輔助波長630 nm）讀取光密度值，繪制標準曲線，求得VEGF的相對含量。

1.7 構建皮下人 HCC模型

雄性BALB/C－nu/nu裸小鼠，4～6周齡，12只，體質量15～18 g，購自國家嚙齒類實驗動物種子中心上海分公司。在恒溫（24～27℃）、恒濕（45%～50%）、無特異病原菌環境下分籠飼養，將水和飼料滅菌處理后供裸小鼠自由攝入。用0.125%胰酶消化對數生長期MHCC－97H細胞，調整細胞濃度（3×107個/m L），取0.2 m L接種于裸小鼠右前肢腋部皮下，接種10 d后將其隨機分為對照組（0.9%氯化鈉液灌胃）和 WP1066治療組［40 mg/（kg·d）灌胃］，灌5 d停2 d，連續給藥6周。每周測量皮下腫瘤長短徑，根據體積＝長徑×短徑2×π/6計算腫瘤體積。給藥6周后采集外周血，分離腫瘤并稱其質量。

2 結 果

2.1 不同轉移潛能HCC細胞株中STAT 3總蛋白及其磷酸化水平的檢測

采用蛋白印跡方法檢測Hep3B、HepG2、MHCC－97L、MHCC－97H 中STAT 3的總蛋白和磷酸化水平，結果顯示STAT3總蛋白在各細胞株中的表現無顯著差異，而STAT3磷酸化水平在轉移潛能高的 MHCC－97H細胞株中顯著升高，提示STAT3的磷酸化水平與HCC細胞的惡性生物學表型相關，見圖1。

圖1 STAT3在HCC細胞株中的磷酸化水平

2.2 WP1066體外對 MHCC－97H增殖和侵襲能力的影響

用0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、6.0μmol/L的 WP1066干預 MHCC－97 H細胞株48 h后，檢測STAT3的磷酸化水平，結果顯示高濃度 WP1066能顯著抑制STAT3磷酸化水平，見圖2。采用2μmol/L和6μmol/L兩個濃度的WP1066干預MHCC－97H，在不同時間點檢測細胞的增殖情況，結果顯示WP1066對HCC細胞增殖的抑制成劑量依賴性，較高劑量的WP1066能有效抑制HCC細胞增殖，見圖3A。取WP1066干預48 h的 MHCC－97H，檢測其侵襲能力的變化，結果顯示 WP1066能顯著抑制MHCC－97 H的侵襲能力，見圖3B。

圖2 WP1066對MHCC－97H細胞株中STAT3磷酸化水平的抑制作用成劑量依賴性

2.3 WP1066對裸鼠成瘤的抑制作用

注射MH－CC－97 H在裸鼠皮下成瘤后，用 WP1066［40 mg/（kg·d）］灌胃。每周測量腫瘤體積1次。6周后獲取腫瘤并稱質量；采集外周血檢測VEGF濃度；提取腫瘤組織中總蛋白并檢測缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF－1α）的表達。結果顯示，WP1066治療組的腫瘤體積［（1085.8±220.1）mm3］和質量［（1.50±0.33）g］均顯著小于對 照 組 ［（1525.4±324.6）mm3和 （2.16±0.34）g，P＜0.05］，說明 WP1066可以有效地抑制HCC的生長。WP1066治療組HIF－1α表達下調，且該組外周血 VEGF［（55.0±18.9）pg/m L］顯著低于對照組［（93.8±18.7）pg/m L］（P＝0.012），見圖4。

3 討 論

STAT3是信號轉導轉錄激活因子家族的重要成員之一，它在細胞內起著重要的信號傳遞作用，能被很多細胞因子和生長因子激活，繼而發生二聚體化進入到細胞核，與下游靶基因啟動子區域的特異位點結合后調節靶基因的表達，從而在細胞的增殖、凋亡、轉移和血管生成以及免疫調節等方面發揮重要作用［3，5－7］。現 有 的 研 究［2－3］提 示，STAT3 是 一 個癌基因，它的異常活化對惡性腫瘤的增殖和轉移起關鍵作用，并與多種腫瘤的發生、發展和預后有密切的關系。

本研究顯示，在具有不同侵襲和轉移潛能的HCC細胞株 Hep3B、Hep G2、MHCC－97 H 和 MHCC－97L中STAT3總蛋白水平無顯著差異，但其在MHCC－97H細胞株中的磷酸化水平顯著升高，提示STAT3磷酸化水平和HCC細胞的惡性表型有一定的相關性。體外應用STAT3抑制劑WP1066干預HCC細胞株，結果顯示WP1066對HCC細胞株中STAT3磷酸化水平的抑制呈劑量依賴性，這與其他腫瘤研究中關于STAT3機制的報道一致［8－9］。2μmol/L的 WP1066可以部分抑制HCC細胞增殖，但和對照組比較差異無統計學意義；6μmol/L WP1066則可以顯著地抑制HCC細胞的增殖和侵襲。

HCC患者常伴有肝硬化，使之難以耐受化療。因此，迫切需要尋找新的針對HCC的靶向治療藥物，使其在充分發揮抗腫瘤作用的同時而不對機體產生不良影響。本研究證實，采用40 mg/（kg·d）的WP1066可以抑制HCC的生長，且對裸鼠體質量無顯著影響。

綜上所述，STAT3信號通路在HCC的增殖和侵襲過程中發揮著重要的作用，STAT3抑制劑WP1066有望成為一種新的分子靶向藥物。STAT3是如何與其他信號通路的關鍵分子聯合發揮作用的則還有待于進一步研究。

［1］Chen M，Therneau T，Orsini LS，et al.Design and rationale of the HCC BRIDGE study in China:a longitudinal，multicenter cohort trial in hepatocellular carcinoma［J］.BMC Gastroenterol，2011，11（5）:53.

［2］Levy DE，Inghirami G.STAT3:a multifaceted oncogene［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（27）:10151－10152.

［3］Niu G，Wright KL，Huang M，et al.Constitutive Stat3 activity up－regulates VEGF expression and tumor angiogenesis［J］.Oncogene，2002，21（13）:2000－2008.

［4］Liu Y，Fuchs J，Li C，et al.IL－6，a risk factor for hepatocellular carcinoma:FLLL32 inhibits IL－6－induced STAT3 phosphorylation in human hepatocellular cancer cells［J］.Cell Cycle，2010，9（17）:3423－3427.

［5］Matsui T，Kinoshita T，Hirano T，et al.STAT3 down－regulates the expression of cyclin D during liver development［J］.J Biol Chem，2002，277（39）:36167－36173.

［6］Kesanakurti D，Chetty C，Dinh DH，et al.Role of MMP－2 in the regulation of IL－6/Stat3 survival signaling via interaction with alpha5beta1 integrin in glioma［J］.Oncogene，2012，29（49）:6152－6160.

［7］Yu H，Kortylewski M，Pardoll D.Crosstalk between cancer and immune cells:role of STAT3 in the tumour microenvironment［J］.Nat Rev Immunol，2007，7（1）:41－51.

［8］Horiguchi A，Asano T，Kuroda K，et al.STAT3 inhibitor WP1066 as a novel therapeutic agent for renal cell carcinoma［J］.Br J Cancer，2010，102（11）:1592－1599.

［9］Hatiboglu MA，Kong LY，Wei J，et al.The tumor microenvironment expression of p－STAT3 influences the efficacy of cyclophosphamide with WP1066 in murine melanoma models［J］.Int J Cancer，2011，130（7）:2812－2823.

Effects of an Inhibitor of Signal Transducer and Activator of Transcription 3，WP 1066，on the Biological Characteristics of Hepatocellular Carcinoma

ZHANG Jubo GUO Kun CHEN Yi GE Ningling

REN Zhenggang Department of Hepatic Oncology，Zhongshan Hospital，Fudan University，Shanghai 200032，China

Objective:To explore the effects of an inhibitor of signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3），WP1066，on the proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma（HCC）cells in vitro and in vivo.Methods:The expression level and phosphorylation level of STAT3 in HCC cell lines with different malignant potential were detected by Western blotting and Transwell method.The antitumor activities of WP1066 and related mechanisms were studied in HCC cell line MHCC－97H and also in a subcutaneous HCC model in nude mice.Results:STAT3 phosphorylation level was significantly higher in HCC cell lines with higher malignant potential.WP1066 significantly inhibited cell proliferation and invasion in MHCC－97H.WP1066 also significantly inhibited the growth of tumor in nude mice HCC model.Conclusions:WP 1066 can suppress the proliferation and invasion of HCC through inhibition of the phosphorylation level of STAT3.

Hepatocellular carcinoma； Inhibitor； Signal transducer and activator of transcription 3； Proliferation； In－vasion

R735.7

A

國家自然科學基金資助項目（編號:30872505、81172275）

任正剛，E－mail:ren.zhenggang＠zs－hospital.sh.cn