活性氧物質和超氧化物歧化酶與稽留流產的關系

朱麗均 陳亞萍 陳炳錦 梅小會

（復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院婦產科，上海 200240）

活性氧物質和超氧化物歧化酶與稽留流產的關系

朱麗均 陳亞萍 陳炳錦 梅小會

（復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院婦產科，上海 200240）

目的:探討絨毛組織中活性氧物質（reactive oxygen species，ROS）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）與稽留流產的關系。方法:選取稽留流產患者20例作為研究組，同時選取正常早孕要求流產者20例作為對照組。研究組胚胎稽留宮內時間小于4周。采用流式細胞儀和化學發(fā)光分析法檢測所有患者絨毛組織中ROS和SOD的水平。結果:與正常早孕女性相比，稽留流產患者絨毛組織中ROS水平顯著增高（P＜0.05），SOD水平顯著降低（P＜0.05）。結論:絨毛組織中ROS和SOD的平衡失調可能是導致稽留流產發(fā)生的重要因素。

活性氧物質； 超氧化物歧化酶； 稽留流產； 流式細胞儀； 化學發(fā)光分析法； 絨毛

稽留流產是指胚胎或胎兒已死亡，但其滯留在宮腔內尚未自動排出，稽留流產的患病率在育齡期女性中可達15%～20%［1］。目前對于稽留流產尚無有效的預防措施，這是因為對它的發(fā)病機制尚未完全明確。研究［2］發(fā)現自然流產與胚胎組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低有關，SOD是一種氧自由基清除劑，據此推測稽留流產可能與胚胎細胞活性氧物質（reactive oxygen species，ROS）的生成和抗氧化防御系統(tǒng)之間的平衡失調有關。因ROS的化學性質極為活潑，所以目前都是通過測定丙二醛等間接指標來反映體內ROS水平［3］。本研究通過直接檢測ROS和SOD在稽留流產患者絨毛組織中的水平，探討兩者與稽留流產的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2010年1月—2011年12月在我院住院的經B超和血絨毛膜促性腺激素β亞單位（human chorionic gonadotropin－β，β－HCG）動態(tài)監(jiān)測證實為稽留流產的患者20例作為研究組（均無流產相關原因）。選取同期經B超證實胚胎存活且要求行人工流產的早孕女性20例作為對照組。研究組患者平均年齡（29.87±5.07）歲，平均孕產次（2.71±1.34）次；對照組平均年齡（26.66±5.33）歲，平均孕產次（2.51±1.21）次。兩組女性胚胎停止發(fā)育的平均時間為停經7～9周。對照組與研究組的年齡、停經孕周及孕產次均無顯著差異（P＞0.05）。

1.2 入組標準

研究組B超檢查結果顯示胚胎未見原始心管搏動，血β－HCG呈下降趨勢（分別于首次就診日、3 d后、6 d后檢測3次）。對照組孕齡不超過12周，術前B超檢查結果顯示孕囊形態(tài)及胚胎原始心管搏動正常。兩組女性既往均無妊娠并發(fā)癥、內外科合并癥、感染、自然流產、早產、死胎和先兆流產等病史以及服藥史。

1.3 標本的采集與處理

無菌條件下，采用負壓抽吸方法吸取絨毛組織。取絨毛組織0.05～0.5 g，以0.9%氯化鈉液漂洗直至血塊洗凈，吸干水分并稱取質量后取部分組織立即檢測ROS，將其余絨毛組織迅速放于液氮罐中待測SOD。

1.4 實驗方法

（1）ROS檢測:取絨毛組織0.05 g，加入0.9%氯化鈉液約450μL，用組織勻漿器勻漿；用吸管吸取組織勻漿，經100目尼龍網過濾到試管內；1000 r/min離心4～5min；再用0.9%氯化鈉液洗3次，每次以500～800 r/min離心以去除細胞碎片；以300目尼龍網過濾去除成團細胞，得到單細胞懸液；取1m L單細胞懸液用流式細胞儀進行ROS檢測。2’，7’－二氯熒光乙酰乙酸鹽（DCFH－DA）是一種能完全自由通過細胞膜的染色劑，其一旦被氧化，便產生熒光二氯熒光素（DCF）。根據以上原理，測得的DCF熒光強度越強，說明ROS的含量越高；（2）SOD活力測定:取胚胎組織0.05 g，加9倍體積的0.9%氯化鈉液，低溫條件下使組織勻漿化，勻漿以2000 r/min離心5 min，取其上清液，用黃嘌呤－黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)以化學發(fā)光分析法測定SOD活力。所用試劑由上海碧云天生物技術研究所提供。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。各項測定值以均數±標準差±s）表示，檢驗方法采用方差齊性檢驗及t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 絨毛組織中ROS的水平

研究組DCF熒光強度與對照組比較顯著升高（P＜0.05），見表1。

表1 研究組與對照組絨毛組織中ROS的水平

2.2 絨毛組織中SOD的水平

研究組SOD酶活力單位與對照組比較顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 研究組與對照組絨毛組織中SOD的水平

3 討 論

3.1 ROS與SOD的作用

ROS又稱反應性氧類物質，包括處于自由子狀態(tài)的氧和不屬于自由基的過氧化氫。細胞內同時存在生成ROS的體系和拮抗其生成的抗氧化劑體系。SOD是體內的重要金屬酶抗氧化劑，催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，生成過氧化氫和分子氧，破壞自由基，防止氧毒性。正常少量生成的ROS會被SOD、谷胱甘肽過氧化酶、過氧化氫酶及維生素E等細胞內外抗氧化劑清除。在缺氧、缺血、化學性放射性損傷、炎性反應以及老化等的氧化還原過程中，ROS生成增多，使脂質、蛋白質和DNA過氧化，分別引起雙層脂質膜的穩(wěn)定性下降、DNA單鏈破壞與斷裂并促進含硫蛋白質的相互交聯(lián)。ROS的強氧化作用是細胞損傷的基本環(huán)節(jié)，ROS和SOD的平衡失調與許多疾病密切相關。

3.2 ROS、SOD 與妊娠的關系

研究［4］顯示妊娠時ROS增多，但同時抗氧化劑如SOD等亦增多，使得氧化和抗氧化在新的水平上得以維持，妊娠得以繼續(xù)。

3.3 ROS、SOD與稽留流產的關系

本研究顯示，稽留流產患者絨毛組織中ROS的水平顯著高于正常早孕女性，而SOD的水平卻顯著低于正常早孕女性，這提示稽留流產患者存在ROS生成和抗氧化防御系統(tǒng)之間的失衡，使細胞內氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變。其可能的機制為:一方面ROS的增加改變了胚胎細胞內的氧分壓，而高氧狀態(tài)抑制了SOD的生成，導致細胞內氧化還原狀態(tài)重度失衡，從而導致胚胎停止發(fā)育，發(fā)生稽留流產；另一方面胚胎滋養(yǎng)層細胞未充分在低氧環(huán)境中發(fā)育即提前進入缺血再灌注過程，產生過多的ROS，形成惡性循環(huán)，從而促進了稽留流產的發(fā)生。

本研究從氧化和抗氧化失衡角度初步探討了ROS和SOD與稽留流產的相關性，為進一步研究稽留流產的發(fā)病機制及預防提供參考。

［1］Beucher G，Beillat T，Dreyfus M.Management of first trimester miscarriages［J］.J Gynecol Obstet Biol Reprod（Paris），2003，32（1）:5－21.

［2］El－Far M，El－Sayed IH，El－Motwally AE，et al.Serum levels of TNF－alpha and antioxidant enzymes and placental TNF－alpha expression in unexplained recurrent spontaneous miscarriage［J］.J Physiol Biochem，2009，65（2）:175－181.

［3］馬秀菊，肖文霞.氧化應激與自然流產的相關性研究［J］.中國婦幼保健，2007，5（22）:622－623.

［4］Burton GJ，Jauniaux E.Oxidative stress［J］.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2011，25（3）:287－299.

Reactive Oxygen Species and Superoxide Dismutase Were Correlated with Missed Abortion

ZHU Lijun

CHEN Yaping CHEN Bingjin MEI Xiaohui Department of Gynaecology and Obstetrics，Shanghai Fifth People’s Hospital，Fudan University，Shanghai 200240，China

Objective:To study whether reactive oxygen species（ROS）and superoxide dismutase（SOD）in placental villous tissue were related with missed abortion.Methods:Twenty patients with missed abortion（study group）and twenty early pregnant women undergoing abortion surgery（control group）were enrolled in this study.In patients with missed abortion the time embryos stayed in uterus after they died was less than four weeks.Fluorescent staining method and chemiluminometry were used to detect the levels of ROS and SOD in placental villous tissue.Results:The level of ROS in the study group was significantly higher than that in the control group（P＜0.05），while the level of SOD in the study group was significantly lower than that in the control group（P＜0.05）.Conclusions:The imbalance of ROS and SOD in placental villous tissue may be an important cause of missed abortion.

Reactive oxygen species； Superoxide dismutase； Missed abortion； Flow cytometry； Chemiluminometry；Villi

R714.2

A

上海市閔行區(qū)自然科學研究課題資助項目（編號:2009MHZ088）