丹參酮ⅡA對正常和氧化損傷內皮細胞的保護作用研究

羅 婷，鐘先鋒，李 靜，劉小如，鄧澤元

南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，南昌330047

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的前期階段，血管內膜附有一層內皮細胞，是非常光滑的，動脈粥樣硬化發生常伴有內皮細胞損傷或脫落［1］，血管內皮細胞的功能障礙是AS發生的始動因素［2］。故進行早期預防內皮細胞功能障礙對AS的發病具有積極的作用［3］。

丹參酮ⅡA(Tanshinone IIA，TIIA)具有明顯的抗氧化應激作用［4］，氧化應激通過產生氧自由基介導血管內皮細胞的損傷，與血管內皮功能障礙有著密切的關系。已有實驗證實丹參酮ⅡA具有抗氧化的作用，并且能夠抑制羥自由基引起的脂質過氧化［5］。本研究以培養的人臍靜脈內皮細胞為材料，觀察丹參酮ⅡA對內皮細胞增殖的影響，探討丹參酮ⅡA保護損傷后的血管內皮細胞和抗動脈粥樣硬化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈內皮細胞株(Human vascular endothelial cells，HUVECs)由南昌大學醫學院提供;DMEM (Invitrogen corporation);胰蛋白酶(Sigma公司); MTT(Sigma公司);胎牛血清(Gibco公司);丹參酮ⅡA(中國生物制品檢定所;批號:110766-200518;純度:98%以上);DMSO(天津大茂公司);乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮合酶(nitrogen oxide synthase，NOS)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)，丙二醛(malondialdehyd，MDA)、一氧化氮(nitric oxide，NO)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 儀器與設備

CO2恒溫恒濕培養箱(SanYo);生物安全柜(蘇凈集團安泰公司);倒置顯微鏡(上海光學儀器進出口有限公司);MK3型酶標儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司);臺式冷凍高速離心機(Heal Force)等。

1.3 方法

1.3.1 內皮細胞培養

人臍靜脈內皮細胞的培養:取人臍靜脈血管內皮細胞接種于50 mL培養瓶內，待細胞鋪滿80%～90%的瓶底表面積后，用0.25%的胰蛋白酶消化1 min，離心，分裝于新的培養瓶中，置37℃、5%的CO2培養箱內培養。第二天換培養液，培養至第3天進行傳代。如上述方法正常培養3代以上后，將內皮細胞分組進行實驗。

1.3.2 MTT法測定丹參酮ⅡA對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響

離心收集對數期細胞，以2×104～5×104個/ mL的密度接種于96孔板中，5%CO2，37℃培養箱中培養24 h后，棄去培養液，用PBS洗去未貼壁細胞。換用無血清的培養基繼續培養8 h，使細胞同步化。然后換用含5%胎牛血清和不同濃度丹參酮ⅡA的DMEM培養液培養，其中丹參酮ⅡA分6個濃度，分別是400、200、100、40、20、10 μmol/L，每組設6個復孔，同時設置調零孔和對照孔。24 h后終止培養，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，在37℃體積分數5%CO2孵育4 h。棄去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，并用酶標儀OD490nm處測定各孔的吸光值。

1.3.3 MTT法測定丹參酮ⅡA對人臍靜脈內皮細胞損傷的保護作用

將細胞分為對照組(在細胞培養體系中不施加任何干預因素)、H2O2組(在細胞培養體系中加入100 μmol/L的 H2O2)和藥物干預組(10～100 μmol/L丹參酮ⅡA+100 μmol/L H2O2)［7］。前期實驗操作同1.3.2，加入丹參酮ⅡA后，培養24 h，加入100 μmol/L H2O2作用內皮細胞6 h，換入無血清DMEM培養液100 μL/孔，并于每孔加入MTT(5 mg/mL)10 μL。繼續培養4 h后，加入DMSO使結晶物溶解，并用酶標儀OD490nm處測定各孔的吸光值。

1.3.4 測定丹參酮ⅡA對內皮細胞LDH、SOD、MDA、NOS、NO和GSH的影響

使用試劑盒，按照試劑盒說明書測定每組內皮細胞中LDH釋放率，MDA、NOS、NO、SOD和GSHPx的變化。

1.3.5 流式細胞術檢測內皮細胞凋亡

實驗分組同1.3.2，內皮細胞用胰酶消化后，PBS洗滌2遍，離心(1000 rpm，5 min)獲取細胞，加入100 μL的Binding Buffer懸浮細胞，使用5 μL FITC和5 μL PI在室溫避光反應10～15 min，離心加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞，在1 h內進行流式細胞儀的檢測。

1.3.6 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件處理實驗數據，單因素方差分析進行顯著性檢驗，并用LSD-t進行了組間差異性比較;所得數據用±s表示，P＜0.05表示差異顯著，具有統計學意義。

2 結果

2.1 丹參酮ⅡA對正常內皮細胞生長的影響

如圖1所示，低劑量添加丹參酮ⅡA對正常內皮細胞的生長沒有影響，但在濃度達到200 μmol/L時，對內皮細胞生長產生抑制作用，可能過量的丹參酮ⅡA會對內皮產生細胞毒性。圖1顯示，丹參酮ⅡA添加濃度于10～100 μmol/L之間時，內皮細胞的存活率沒有明顯影響，但當上升到400 μmol/L，內皮細胞的存活率也于100%下降到57.4%，隨著丹參酮ⅡA添加濃度的升高，丹參酮ⅡA對血管內皮細胞生長抑制作用越來越明顯，呈現濃度依賴關系。

圖1 丹參酮ⅡA對內皮細胞增殖的影響Fig.1 The effect of Tanshinone IIA on the proliferation of HUVECs

2.2 丹參酮ⅡA對內皮細胞損傷的保護作用

根據2.1的實驗結果，本實驗選擇了較低濃度(5～100 μmol/L)的丹參酮ⅡA來保護內皮細胞，以排除細胞毒性的影響。從圖2可以看到，丹參酮ⅡA對內皮細胞的保護作用顯濃度依賴關系。比較藥物添加各組和H2O2組，添加5、10 μmol/L的丹參酮ⅡA對內皮細胞的保護作用不明顯(P＜0.05)，而添加量上升到20 μmol/L，則有顯著的保護作用。

圖2 丹參酮ⅡA對內皮細胞損傷的保護作用Fig.2 Protective effects of Tanshinone IIA on HUVECs from oxidative injury

2.3 丹參酮ⅡA對內皮細胞 LDH、SOD、MDA、NOS、NO和GSH的影響

從表1可以看到，H2O2組的LDH釋放率和MDA與對照組相比顯著上升，LDH釋放率從36.28%上升到54.89%，MDA從23.78 nmol/mg prot上升到45.70 nmol/mg prot。加入丹參酮ⅡA處理后，LDH釋放率和MDA有不同程度下降，如100 μmol/L丹參酮ⅡA預處理組與H2O2組比較，LDH釋放率下降為44.75%，MDA下降為33.57 nmol/mg prot，說明內皮細胞經丹參酮ⅡA預處理，可以抵御氧自由基損傷，降低細胞脂質過氧化物，維護生物膜的完整性。

NOS是維持內皮細胞生理功能的重要活性物質，能清除體內自由基。NO可促進血管舒張，并抑制增生作用［6］。H2O2組與對照組相比，內皮細胞NOS表達減少，其產物NO水平也隨之降低，隨著丹參酮ⅡA加入，NO水平回升。

細胞內同時存在清除過量氧自由基的系統，如SOD和GSH-Px，這些抗氧化酶可以保護內皮細胞，維持細胞膜結構和正常生理功能的作用。本研究表明:與對照組相比，H2O2組SOD和GSH-Px活性顯著降低。與H2O2組相比，50和100μmol/L丹參酮ⅡA均可增強內皮細胞的SOD、GSH-Px活性，SOD活力分別為112.51 U/mgprot和131.37 U/mgprot (P＜0.05);GSH-Px活力分別為176.52 U/mgprot和212.96 U/mgprot(P＜0.05)。且隨濃度的增加，細胞的SOD和GSH-Px活性也逐漸提高，表明丹參酮ⅡA可增強內皮細胞的抗氧自由作用，具一定的量效關系。

表1 丹參酮ⅡA對人臍靜脈內皮細胞LDH、MDA、NOS、NO、SOD和GSH-PX的影響Table 1 Effects of Tanshinone IIA on LDH，MDA，NOS，NO，SOD，GSH-PX in HUVECs

2.4 丹參酮ⅡA對內皮細胞凋亡的影響

從圖3可以看到，人臍靜脈內皮細胞經H2O2氧化損傷后，41.7%的細胞進入早期凋亡，2.1%的細胞進入晚期凋亡或者壞死，而丹參酮ⅡA預處理組(50 μmol/L)，有23.2%的細胞進入早期凋亡，0.6%的細胞進入晚期凋亡或者壞死，提示丹參酮ⅡA可以保護內皮細胞免受氧化損傷，降低細胞凋亡率，維持正常生理功能防止AS的形成。

圖3 FITC-PI通道的二維散點圖Fig.3 Bivariate graphs illustrate the FITC-PI fluorescent resolution of HUVECs

3 討論

人體內多種因素導致血管內皮細胞損傷，如炎癥因子、失去平衡的調節因子、活性氧、脂肪氧化酶等，其中活性氧產生的氧化損傷是其中重要的因素之一［7］。人體正常生理活動過程伴有氧化性物質參與，主要為氧自由基。氧自由基可以參與人體的物質代謝和信號傳導，對細胞發揮正常生理功能起著重要作用。但是人體產生過量氧自由基或者清除能力下降時，則對人體內各種細胞產生不可逆的氧化損傷。

實驗室為了建立氧化損傷模型，多采用H2O2、乙醇和ox-LDL等試劑，本研究利用H2O2產生O來建立HUVECs損傷模型，因為該系統經濟科學，方便易行，適于快速誘導損傷建立模型，進而大量篩選藥物。綜合文獻和預實驗數據分析，本文采用200 μmol/L的H2O2誘導內皮細胞損傷。

從自然界中提取的部分植物化合物對細胞有細胞毒性，在研究各種化合物對細胞的保護作用時，實驗設計的藥物濃度應在不產生細胞毒性的范圍內。在本研究中，當丹參酮ⅡA添加濃度上升到200μmol/L，對HUVECs的增殖產生抑制作用，有顯著性差異(圖1)。所以本研究的實驗方案設計的藥物濃度為5～100 μmol/L。

氧自由基損傷細胞膜上的脂質，使其過氧化分解生成脂質過氧化物，如MDA。MDA能與蛋白質、氨基酸及其它細胞成分作用，最終使磷脂結構發生變化，生物膜受到嚴重的損害，致使細胞活力下降，同時細胞內的LDH外漏［8］。丹參酮ⅡA也促進了NOS和NO的生成量(表1)，為了應對氧化應激，恢復平衡狀態，相對正常分泌水平過量產生的NOS和NO能清除體內自由基，維持血管正常生理功能。隨著丹參酮ⅡA加入，NO水平回升。丹參酮ⅡA也促進了SOD和GSH-PX的分泌，SOD和GSH-PX是體內清除過量氧自由基的系統，能消除人體在吸收代謝過程中生成的有毒有害物質，如超氧陰離子自由基，體內依靠SOD和GSH-PX系統可以維持細胞內的氧化還原狀態的平衡。

研究證實在動脈粥樣硬化的斑塊中存在著血管內皮細胞的凋亡現象。而且血管內皮細胞位于血管最內層，直接與循環血液接觸，因此較易受到血液中活性物質及血液剪切力的影響，在心腦血管疾病的發生過程中處于關鍵環節［9］。細胞凋亡導致細胞核內的DNA因漏出而減少，加入丹參酮ⅡA預處理后，大大減少了凋亡率，保持了內皮細胞的正常活力和生理功能。

綜合上述，丹參酮ⅡA在10～100 μmol/L濃度下，無細胞毒性;加入丹參酮ⅡA預處理后，減弱了因H2O2引起的細胞的過度脂質過氧化，維持細胞膜結構，減少了LDH釋放率和MDA生成量，增加了NOS、NO、SOD和GSH等抗氧化物質的分泌量，阻礙了細胞凋亡和在血管表皮上形成動脈粥樣硬化斑塊，阻止AS的發生和發展。

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