海兔素對人乳腺癌SK-BR-3細胞的抑制作用及機制研究

馬文龍，梁 惠，劉 穎

1陜西省楊凌示范區醫院，楊凌712100;2青島大學醫學院，青島266021

表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)的自體磷酸化及其對下游Akt和ERK等效應分子的活化作用，在促進腫瘤細胞的生長、增殖和分化過程中發揮重要作用。近年來，尋找阻斷EGFR細胞信號傳導通路的藥物，成為人們進行抗癌藥物研究的熱點。隨著海洋抗腫瘤活性物質的不斷開發利用，海藻萜類化合物因其結構獨特、生物活性強，日益引起人們的廣泛關注［1］。研究表明，很多萜類化合物對乳腺癌、黑色素瘤、結腸癌等多種腫瘤細胞都具有良好的抑制作用［2-4］。三列凹頂藻(Laurencia tristicha)屬紅藻門(Rhodophyta)，紅藻綱(Rhodophyceae)，仙菜目(Ceramiales)，松節藻科(Rhodomelaceae)，凹頂藻屬(Laurencia)，是海洋萜類化合物的重要來源。海兔素(Aplysin)是存在于三列凹頂藻中的一種溴代倍半萜類化合物，本課題組前期從三列凹頂藻中提取純化了海兔素，并對乳腺癌的抑制作用進行了體內外實驗。結果表明，海兔素可明顯抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖，并顯著抑制細胞中VEGF表達;動物實驗也表明，海兔素無毒副作用，使用安全，可有效抑制二甲基苯蒽誘導的乳腺癌腫瘤組織中VEGF的表達，且具有量效依賴性［5］。但關于從阻斷細胞信號傳導通路方面闡述海兔素抑瘤機制的研究較少，國內外也未見相關報道。本實驗以海兔素為干預物，觀察其對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響，并通過EGFR信號通路，進一步探討海兔素誘導細胞凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1.1 溴代倍半萜海兔素的制備

三列凹頂藻由中國科學院海洋研究所提供并鑒定。由青島大學醫學院醫學營養研究所將常溫風干的海藻樣品(5 kg)，用體積分數為0.95的乙醇室溫浸泡3 d，提取3次，提取液減壓濃縮(溫度低于40℃)得乙醇提取物325 g;然后將乙醇提取物懸浮于蒸餾水中，用乙酸乙酯萃取，有機相回收溶劑得萃取物105 g。取乙酸乙酯萃取物，干法上樣，進行正相硅膠柱色譜分離，用石油醚丙酮梯度洗脫，薄層色譜檢查，合并相同部分。洗脫液經過反復正相硅膠、生物膠Bio-beads、凝膠Sephadex LH-20柱色譜和反相HPLC分離純化，得到一白色化合物，經 IR、13C-及1H NMR鑒定此化合物為溴代倍半萜海兔素單體(Aplysin)，分子式為C15H19OBr，分子量為295。

1.2 細胞株、主要試劑及儀器

人乳腺癌細胞 SK-BR-3，為本實驗室所有。DMEM/F12培養液和胎牛血清購自Gibco公司;Cell Counting Kit-8試劑盒購自日本Dojindo公司;Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I試劑盒購自美國BD Pharmingen公司;蛋白裂解液(PRO-PREPTM Protein Extraction Solution)由韓國 iNtRON Biotechnology公司生產;蛋白檢測試劑盒(Bio-Rad Protein Assay)購自美國Bio-Rad公司;羊抗人GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司，二抗購自美國invitrogen公司;EGFR、phospho-EGRF、Akt、phosphor-Akt、ERK、Phospho-ERK兔抗人抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司，其相應的二抗均購于美國ZYMED公司;化學發光試劑盒(chemiluminescence detection kit)購自美國Santa Cruz公司;流式細胞儀為Beckman Coulter公司制造;酶標儀為Thermo公司制造;膠片沖洗機(CP1000型)為德國AGFA-Gevaert NV公司制造。

1.3 細胞培養及海兔素貯存液的配制

乳腺癌SK-BR-3細胞用DMEM/F12全培養液(含體積分數為0.1的胎牛血清)，于37℃，5%CO2水汽培養箱中常規培養。隔天換液一次，三天傳代一次，收集指數生長期細胞進行實驗。海兔素以二甲亞砜(DMSO)助溶，使用時用DMEM/F12全培養液稀釋至終濃度，所有處理組DMSO終濃度體積分數均為0.001(實驗證實該濃度對細胞無明顯損害)。

1.4 CCK-8實驗檢測海兔素對乳腺癌細胞增殖的影響

收集指數生長期細胞，按2×104/孔接種于96孔板。培養24 h后，實驗組加入藥物終濃度分別為10、20、30、40、45、50、55、60 mg/L的培養液;對照組加入含等體積PBS的培養液，每組設3個復孔。繼續培養24 h，吸棄上清，每孔加入100 μL新鮮培養液及10 μL CCK-8溶液，繼續培養2 h，于酶標儀450 nm處測定各孔OD值，OD值的大小與細胞活性呈正相關。以SPSS 11.5軟件計算IC25和IC50，抑制率=(OD對照組-OD實驗組/OD對照組)× 100%。實驗重復三次。

1.5 流式細胞術(FCM)檢測細胞凋亡情況

指數生長期細胞經 IC25和 IC50劑量海兔素(29.4和33.7 mg/L)處理24 h后，用胰酶常規消化并收集細胞。以預冷的PBS洗滌細胞兩次，用1×緩沖液調整細胞密度為1×106/mL，然后吸取100 μL細胞懸液于流式細胞儀專用分析試管中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI溶液，輕輕吹打均勻，置于室溫，避光孵育15 min。加入400 μL 1×緩沖液，通過流式細胞儀分析細胞凋亡情況。以正常未染色細胞對儀器進行調試，分別以FITC Annextin V和PI單染細胞進行熒光補償調節和正常與凋亡細胞象限的界定，數據經WinMDI2.9軟件分析，總凋亡細胞百分數等于中晚期凋亡細胞(Annexin VFITC+/PI+)與早期凋亡細胞(Annexin V-FITC+/ PI－)百分數之和。實驗重復三次。

1.6 Western blot檢測細胞中EGFR、Akt及ERK的總蛋白和磷酸化蛋白相對表達水平

指數生長期細胞經 IC25和 IC50劑量海兔素(29.4和33.7 mg/L)處理24 h后，用胰酶常規消化并收集細胞。以預冷的PBS洗滌細胞兩次，每管加入150 μL細胞裂解液和10 μL磷酸酶抑制劑，在冰上裂解30 min，4℃12000 rpm，離心15 min，收集上清液，用蛋白檢測試劑盒測定蛋白質濃度。蛋白質樣品與上樣buffer混合后，沸水中煮沸10 min。每孔上樣10 μg，經4%～12%SDS-PAGE分離樣品后，將蛋白轉至PVDF膜上，以封閉液(5%脫脂奶粉，溶于TBS)室溫封閉1 h。將膜與溶于抗體稀釋液(5%脫脂奶粉，溶于PBS-T)中的一抗(GAPDH抗體1∶1000、EGFR抗體1∶1000，phospho-EGRF抗體1∶1000、ERK抗體1∶1000、phospho-ERK抗體1∶1000、Akt抗體1∶1000、phosphor-Akt抗體1∶1000)封于塑膠袋中，4℃搖晃孵育過夜。PBS-T洗脫5次，每次5 min，將膜與溶于抗體稀釋液的二抗室溫孵育1 h，PBS-T洗脫5次，每次5 min。采用化學發光試劑盒，對膜進行暗室曝光后，經膠片沖洗機顯影，定影后，結果經掃描后輸入計算機，經IMAGE-J軟件進行圖像分析。實驗重復三次。

1.7 統計學分析

采用SPSS 11.5統計軟件進行數據統計分析，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05被認為有統計學意義。

2 結果

2.1 海兔素對SK-BR-3細胞增殖的影響

CCK-8結果顯示，經海兔素處理24 h后，對SKBR-3細胞的增殖具有抑制作用，且呈劑量依賴性。其中，10 mg/L海兔素組與對照組比較，無顯著性差異(P＞0.05)，其余各藥物組與對照組比較以及藥物組之間比較，均表現出顯著性差異(P＜0.05)。藥物濃度越高，對細胞增殖的抑制作用也越明顯，當海兔素劑量達到55 mg/L時，99%以上的細胞已經死亡(Table 1、Fig 1)。以SK-BR-3細胞OD值對藥液濃度值作藥物量效的線性回歸分析顯示，兩者間存在線性關系，給藥濃度與細胞OD值呈負相關(y =-0.04x+2.39，r=0.96，P＜0.05，x為藥液濃度，y為SK-BR-3細胞的OD值)。計算出海兔素作用SK-BR-3細胞24 h的IC25和IC50值為分別為29.4和33.7 mg/L。

表1 海兔素對SK-BR-3細胞增殖的影響Table 1 The effects of Aplysin on the proliferation of SK-BR-3 cell(n=4，±s)

表1 海兔素對SK-BR-3細胞增殖的影響Table 1 The effects of Aplysin on the proliferation of SK-BR-3 cell(n=4，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;與10 mg/L組比較，▲P＜0.05;與20 mg/L組比較，△P＜0.05;與30 mg/L組比較，★P＜0.05;與40 mg/L組比較，☆P＜0.05;與45mg/L組比較，※P＜0.05;與50 mg/L組比較，#P＜0.05。Note:Compare with control，*P＜0.05;Compare with 10 mg/Lgroup，▲P＜0.05;Compare with 20 mg/L group，△P＜0.05;Compare with 30 mg/ Lgroup，★P＜0.05;Compare with 40 mg/L group，☆P＜0.05;Compare with 45 mg/L group，※P＜0.05;Compare with 50 mg/Lgroup，#P＜0.05.

組別Group 劑量Dose(mg/L)吸光度值OD450nm抑制率Inhibition ratio(%) 25%抑制劑量IC25(mg/L) 50%抑制劑量IC50(mg/L) Control － 2.062±0.026 0.00 29.4 33.7海兔素Aplysin 10.00 2.057±0.026 0.24對照組99.17 20.00 1.903±0.072＊▲ 7.71 30.00 1.397±0.107＊▲△ 32.25 40.00 0.576±0.119＊▲△★ 72.06 45.00 0.170±0.015＊▲△★☆ 91.75 50.00 0.050±0.018＊▲△★☆※ 97.57 55.00 0.017±0.001＊▲△★☆※# 99.17 60.00 0.017±0.004＊▲△★☆※#

圖1 海兔素對SK-BR-3細胞增殖的影響Fig.1 Effects of aplysin on proliferation of SK-BR-3 cells

2.2 海兔素對SK-BR-3細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示，SK-BR-3細胞經IC25和IC50劑量的海兔素處理24 h后，可分析得到明顯的凋亡細胞(包括早期凋亡細胞和中晚期凋亡細胞)，IC25和IC50藥物處理組的細胞凋亡率分別是(16.7±1.4)%和(58.3±2.4)%，明顯高于正常對照組凋亡率(0±1.2)% ，經統計學處理，有顯著性差異(P＜0.05)，見Fig.2。

圖2 海兔素劑量依賴性誘導SK-BR-3細胞凋亡Fig.2 Dose-dependent apoptosis in SK-BR-3 cells induced by aplysin

2.3 海兔素對SK-BR-3細胞中EGFR總蛋白和磷酸化蛋白相對表達水平的影響

結果顯示，經IC25和IC50劑量海兔素處理SKBR-3細胞24 h后，細胞中EGFR總蛋白表達水平未見明顯降低，與對照組比較，無顯著性差異(P＞0.05);而EGFR磷酸化蛋白的表達則明顯受到抑制，且隨著藥物濃度的增大，表達水平逐漸降低，實驗組與對照組比較及實驗組間比較，差異均具有顯著性(P＜0.05)，見Fig.3。

圖3 海兔素對SK-BR-3細胞EGFR總蛋白和磷酸化蛋白表達的影響Fig.3 Effects of aplysin on the expression of phosphorylated and total EGFR in SK-BR-3 cells

2.4 海兔素對SK-BR-3細胞中ERK和Akt總蛋白和磷酸化蛋白相對表達水平的影響

結果顯示，經IC25和IC50劑量海兔素處理SKBR-3細胞24 h后，細胞中ERK和Akt總蛋白表達水平均未見明顯降低，與對照組比較，無顯著性差異(P＞0.05);而ERK和Akt磷酸化蛋白的表達均明顯受到抑制，且隨著藥物濃度的增大，表達水平均逐漸降低，實驗組與對照組比較及實驗組間比較，差異均具有顯著性(P＜0.05)，見Fig.4和Fig.5。

3 討論

腫瘤是一種多基因異常性疾病，其發病涉及多種原癌基因和抑癌基因的結構和功能異常。原癌基因異常激活和過表達，會引起相應細胞信號轉導通路的調控紊亂，使細胞失去正常生長調控，出現無限增殖和凋亡抑制，從而導致腫瘤形成。EGFR是c-(erbB)-1原癌基因編碼的170 kD跨膜糖蛋白，EGFR信號轉導途徑在腫瘤細胞增殖、損傷修復、侵襲及新生血管形成等方面起重要作用。EGFR活化可激活多種下游信號途徑，產生多種生物學效應。本課題組研究表明，海兔素是一種安全低毒的天然抗腫瘤活性物質，可抑制多種腫瘤細胞的生長增殖和誘導腫瘤細胞凋亡，但其具體機制尚不明了［6-7］。本研究選擇與調控細胞凋亡密切相關的蛋白EGFR及其下游效應分子ERK和Akt，檢測其表達情況，以探討海兔素誘導細胞凋亡的作用機制。本文證實了海兔素可以通過阻斷EGRF/ERK和EGFR/Akt信號通路，抑制人乳腺癌細胞SK-BR-3增殖并誘導其發生凋亡。

本實驗中，CCK-8結果顯示，海兔素能抑制乳腺癌細胞SK-BR-3的增殖，呈劑量依賴性。流式細胞術結果表明，海兔素可誘導SK-BR-3細胞凋亡，且隨藥物劑量增加，細胞凋亡率明顯提高，其中，IC50劑量海兔素可誘導相當高比例的SK-BR-3細胞凋亡，凋亡率達到(58.3±2.4)%，表明海兔素能通過抑制SK-BR-3細胞增殖，誘導細胞發生凋亡，最終抑制乳腺癌細胞生長。

本實驗經Western blot檢測還發現，海兔素雖不能抑制膜受體蛋白EGFR及其下游效應分子ERK和Akt總蛋白的表達，但可顯著抑制EGFR蛋白磷酸化水平，并使下游效應分子ERK和Akt的激活明顯受到影響，且隨著藥物濃度增加，EGFR、ERK和Akt的磷酸化水平均顯著下降，呈量效依賴性。EGFR受體及其下游效應分子是腫瘤細胞增殖過程中的重要調節因子［8，9］，EGRF與其配體相結合后，發生二聚化和自體磷酸化，進而激活下游的PI3K/ AKT和(或)RAS/MAPK信號通路，從而促進腫瘤細胞的惡性增殖［10，11］。EGFR受體被激活后，經細胞質中各種銜接蛋白酶的級聯反應，將信號傳導至細胞核內。其中，最主要的信號通路包括MAPK通路，PI3K通路和c-Src通路。ERK1/2是MAPK通路中重要的成員之一，EGFR近膜信號發生后，可誘導絲氨酸/蘇氨酸酶Raf和ERK1/2激酶特異性地激活ERK1/2，最終通過調節轉錄因子，如Elk-1、cfos等，提高相關基因表達水平，進而促進細胞的增殖［12］。Akt是PI3K信號通路下游一個重要的靶分子，當 EGFR與配體結合被激活后，其下游分子Gab1被磷酸化，作為船塢蛋白招募大量的下游信號蛋白，特別是PI3K和Akt，這兩種效應分子可通過刺激大量相關蛋白(如調節FasL表達的Forkhead家族轉錄因子、caspase-9、GSK-3β、NF-κB等)的磷酸化來促進腫瘤細胞的生長增殖。由于EGFR蛋白必須與配體結合才能發生自體磷酸化，以激活下游效應分子，因此，本研究提示，海兔素抑制EGFR蛋白磷酸化的機制，可能是其阻斷了EGFR與相應配體的結合，這一發現為海兔素對乳腺癌治療作用的研究提供了一定的理論依據，本課題將對此進行進一步的深入探討。

綜上所述，海兔素可有效抑制乳腺癌SK-BR-3細胞的生長增殖并誘導細胞凋亡，作為一種抗腫瘤海洋天然活性物質，值得進一步開發利用和深入探索。

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