HPLC測定中藥百合中2個甾體皂苷的含量

傅春燕，劉永輝，李明娟，王曉慧，尹文清

1邵陽醫學高等專科學校;2湖南省新邵縣紅十字會醫院，邵陽422000; 3廣西師范大學化學化工學院藥用資源化學與藥物分子工程教育部重點實驗室，桂林541004

百合(Lilium browni)為百合科多年生草本植物，其地下鱗莖部位可藥食兩用。據醫藥典籍《本草綱目》記載，百合味甘、微苦、性平，具有補益心肺、固腎、補腦、清心、安神、鎮靜、清潤肺燥、調理脾胃、益氣調中、清熱止咳、養陰止血、消暑等功效［1］。藥理研究表明百合具有滋陰、潤肺、增強肌體免疫、抗腫瘤、降血糖、抗氧化活性等功效［2，3］，臨床用百合及以百合為主藥治療燥咳、精神分裂癥、更年期綜合癥、糖尿病等［2］。百合鱗莖主要含有甾體皂苷類化合物［4-6］。在前期研究中，筆者從百合醇提物中分離得到兩個甾體皂苷，26-O-β-D-吡喃葡萄糖-3β，26-二羥基-5-膽甾烯-16，22-二氧3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)和26-O-β-D-吡喃葡萄糖-3β，26-二羥基-5-膽甾烷-16，22-二氧3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)。本文采用高效液相色譜對中藥百合中化合物1和2進行了含量測定，以實現對百合藥材較為全面的質量控制。

1 儀器與試劑

島津Prominence LC-20A高效液相色譜系統，雙波長紫外檢測器，島津 LCsolution色譜工作站;Sartorious BT 25S型1/100 000電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);2500DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。2個甾體皂苷均為自制(實驗室自制，經UV，NMR，MS，IR鑒定，HPLC純度不低于98%)，符合定量要求。乙腈(色譜純);水為屈臣氏蒸餾水;其他試劑均為分析純。中藥百合由湖南康爾佳中藥飲片廠提供，藥材由廣西師范大學生命科學院唐紹清教授鑒定為百合科百合屬植物百合(Lilium brownii F.E.Brown var.viriulum baker)地下鱗莖部分。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備

百合干燥鱗莖1.0 g用30 mL 70%甲醇超聲(功率:140 w，頻率:42 KHz)提取60 min，即得百合藥材甲醇提取物，置100 mL量瓶中，加流動相超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，備用。

2.1.2 供試品處理的正交實驗

采用正交試驗L9(34)進行百合藥材的甲醇超聲提取工藝研究，以化合物1和2的含量為評價指標，選擇甲醇濃度(60%，80%，100%)、料液比［1∶30，1∶40，1∶50(g/mL)］、超聲時間(20 min，40 min，60 min)3個因素，每個因素設3個水平。結果表明，各因素對2種成分的總含量影響順序為甲醇濃度＞料液比＞超聲時間，確定最佳提取工藝為70%甲醇30倍量，超聲處理60 min。

精密稱取百合3份，每份1.0 g，按照上述最佳工藝進行超聲提取，并按供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件下精密吸取10 μL進樣分析。結果表明，本法的提取效果較好，見表1。

2.1.3 對照品溶液的制備

精密稱取對照品化合物1和化合物2適量，用流動相配置成質量濃度分別為:0.515 mg/mL和0.628 mg/mL的對照品溶液，備用。

2.2 色譜條件及系統適應性實驗

色譜柱:Shim-pack VP-ODS色譜柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%H3PO4水溶液(B)梯度洗脫，29%～30%A(0～15 min);流速:1 mL/min;檢測波長:205 nm;柱溫:30℃。依上述色譜條件，分別精密吸取化合物1和化合物2兩種對照品溶液和供試品溶液各10 μL，分別進樣。分別精密吸取化合物1、化合物2對照品溶液及供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1)。結果表明，在“2.2”色譜條件下，樣品中化合物1和化合物2的色譜峰與其他組分分離良好，對照溶液及樣品溶液主峰的保留時間一致。理論塔板數以化合物1計不低于5000。

圖1 對照品和供試樣品的HPLC色譜圖(A-化合物1;B-化合物2;C-供試樣品)Fig.1 HPLC Chromatograms of reference substances and sample(A-compound 1;B-compound 2;C-sample)

2.3 線性關系考察

在“2.2“項的色譜條件下，分別精密吸取化合物1和化合物2對照品溶液2、4、6、8、10、12和20 μL，注入液相色譜儀，記錄各色譜峰峰面積。以對照品量(μg)為橫坐標，色譜峰峰面積為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線。化合物1和2的線性方程，線性范圍和相關系數見表1。

2.4 精密度考察

取百合鱗莖甲醇提取物，按“2.1”項下方法，制備供試品溶液。在“2.2”項的色譜條件下，精密吸取供試品溶液10 μL，連續進樣6次，測定化合物1和化合物2色譜峰峰面積的RSD分別為1.01%和0.83% ，表明儀器的精密度良好。

2.5 穩定性考察

取“2.4”項下供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h進樣，測定1和2的色譜峰峰面積，RSD分別為1.13%和1.45%。表明樣品在24 h內基本穩定。

2.6 重復性考察

取百合鱗莖甲醇提取物，精密稱定6份，按“2.1”項下方法法，制備供試品溶液，平行測定峰面積。計算得1和2的RSD分別為2.44%和1.96%，表明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收率考察

稱取“2.6”項下的同一批百合鱗莖甲醇提取物6份(含1 0.028%，2 0.041%)，每份1.5000 g，精密稱定，分別精密加入化合物1和化合物2對照品溶液適量，依法制備樣品，并按照“2.2”項下色譜條件測定，計算回收率。結果見表2和表3。

2.8 樣品含量測定

精密稱取3批百合鱗莖甲醇提取物各3份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進行測定。以外標法計算各成分的含量。結果見表4。

3 討論

表2 化合物1加樣回收率考察結果(n=6)Table 2 Recovery of compound 1 in the samples(n=6)

目前，測定中藥材中皂苷類物質的方法研究上，采用高效液相色譜法可以克服傳統方法(例如比色法、重量法等)帶來的誤差大，重復性不好等諸多缺點。本文首次建立了百合中2種甾體皂苷的高效液相色譜分析方法，為百合藥材的質量控制提供依據。

表3 化合物2加樣回收率考察結果(n=6)Table 3 Recovery of compound 2 in the samples(n=6)

表4 3批樣品含量測定結果(%;n=3)Table 4 Determination results of the three batch samples(%; n=3)

試驗考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水及乙腈-磷酸水體系。結果表明，在乙腈-0.1%磷酸水流動相體系中，2種成分分離良好，且無干擾，故選擇該流動相體系。實驗結果表明，采用HPLC法，在本文建立的色譜條件下，可測定百合藥材中2種甾體皂苷的含量，所測成分色譜峰與其它成分分離良好，方法簡便快速，結果準確可靠，可作為其質量控制方法之一。

1 Wu XB(吳曉斌)，Ren FL(任鳳蓮)，Qiu CG(邱昌桂)，et al.Extraction of saponins from Lilium browni and its scavenging effect on hydroxyl radical.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2005，17:777-780.

2 Guo ZH(郭朝暉)，Jiang SX(蔣生祥).Research and application of lily.Acta Chin Med Pharmacol(中醫藥學報)，2004，32(3):27-29.

3 Huang YP(黃燕萍).Lily research.China Pharm(中國藥業)，2010，19(8):88-90.

4 Hou XY(侯秀云)，Chen FK(陳發奎)，Wu LJ(吳立軍).A new steroidal saponin of Lilium browni.Chin J Med Chem(中國藥物化學雜志)，1998，8:49.

5 Hou XY(侯秀云)，Chen FK(陳發奎).Studies on chemical constituents of Lilium browni.Acta Pharm Sin(藥學學報)，1998，33:923-926.

6 Yang XW(楊秀偉)，Cui YX(崔育新)，Liu XH(劉雪輝). NMR characteristics of lililancifoloside A and steroidal saponins.Chin J Mag Reson(波譜學雜志)，2002，19:301-308.