木豆葉醇提物對皮質酮誘導的PC12細胞損傷的保護作用

姜保平，劉亞旻，李宗陽，宋 波，潘瑞樂

中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京100193

抑郁癥(depression)是一種高發病、高致殘、高復發的精神疾病。臨床研究表明抑郁癥病人的下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic pituitary adrenal axis，HPA)功能亢進，血中糖皮質激素水平顯著升高［1］。而持續高濃度糖皮質激素可以導致淋巴細胞、皮層及海馬神經細胞損傷［2］。PC12細胞株為大鼠腎上腺嗜鉻細胞克隆化細胞株，分化的PC12細胞有典型的神經細胞特征，其胞膜上糖皮質激素受體表達豐富［3］。用高濃度的皮質酮誘導PC12細胞損傷，已成為研究抑郁癥的一種常用體外模型［4］。

木豆葉為豆科木豆屬植物木豆［Cajanus cajan (L.)Millsp.］的干燥葉子。現代研究表明木豆葉主要成分有芪類和黃酮類化合物，具有抗骨質疏松、降血脂、抗老年性癡呆等多種藥理活性［5，6］。而木豆葉提取物對皮質酮損傷的PC12細胞的保護作用，國內外未見文獻報道。

本研究用高濃度的皮質酮與PC12細胞共同孵育，模擬抑郁癥病人的大腦神經元損傷狀態，以此觀察木豆葉醇提物及不同組分對神經細胞的保護作用，為木豆葉中抗抑郁新藥研發提供科學依據。

1 材料

1.1 藥材

木豆葉采自廣西鳳山縣，經中國醫學科學院藥用植物研究所張本剛教授鑒定為木豆屬植物木豆的干燥葉子。

1.2 試劑

大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞(上海細胞庫);精制胎牛血清、DMEM高糖培養基(Gibco公司);二甲基亞砜 DMSO、MTT、Corticosterone(Sigma公司); LDH檢測試劑盒(STANBIO，USA)。

1.3 儀器

純水儀(美國Millipore公司);二氧化碳培養箱(NAPCO 6500 TC法國);連續波長酶標儀(美國BIO-TEK)。

2 方法

2.1 樣品制備

用80%乙醇回流提取干燥木豆葉3次，每次1 h，合并濾液，減壓回收乙醇，即得乙醇浸膏。乙醇浸膏溶解后，與硅膠拌勻，干燥;用索氏提取器提取，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和95%的乙醇洗脫，分別減壓濃縮即得石油醚洗脫部位(PEP)、二氯甲烷洗脫部位(DMP)、乙酸乙酯洗脫部位(EAP)和乙醇洗脫部位(EP)。

2.2 PC12細胞培養

PC12細胞液置于15 mL的離心管中，1000 rpm，離心5 min，棄上清液，將細胞用含有5%胎牛血清和10%馬血清的高糖DMEM培養基懸浮，分裝于25 mL的培養瓶中，置于37℃的二氧化碳培養箱中培養，每2～3 d換液1次。

2.3 PC12細胞皮質酮損傷模型的建立

PC12細胞培養至對數生長期，用含5%胎牛血清、10%馬血清的DMEM培養基(含青霉素鈉200 kU/L，鏈霉素100 mg/L，pH 7.4)重懸細胞，調細胞濃度為每毫升1×105個。細胞接種于96孔板中，各孔加入100 μL細胞液，置于37℃、CO2培養箱中貼壁培養2～4 d，待細胞長滿孔底后即可用于實驗。加入不同濃度的皮質酮(0.01、0.1、1、10、100 μmol/ L)，作用12、24和48 h后，用MTT法檢測細胞的活力，利用酶標儀在570 nm處測定各組細胞吸光度A值。以對照組平均吸收值為100%，以各處理組吸收值與對照組的比值計算存活率。

2.4 木豆葉醇提物及不同組分對皮質酮損傷的PC12細胞存活力影響

將PC12細胞以每毫升約1×105個接種于96孔板(每孔100 μL)，正常培養24 h后加入終濃度100 μmol/L皮質酮損傷PC12細胞48 h，加入不同濃度(12.5，25，50，100，200 μmol/L)的木豆葉醇提物及不同組分作用24 h后，用MTT法檢測細胞存活率，在多功能酶標儀上測定570 nm的吸收度值。

2.5 乳酸脫氫酶活性測定

細胞以每孔1×105個接種于24孔中，培養24 h后加入100 μmol/L的皮質酮損傷細胞48 h，加入不同濃度的木豆葉醇提物及不同組分作用24 h后，收集細胞上清液，按照說明書的方法測定LDH活性。

2.6 數據處理

圖1 不同濃度皮質酮作用PC12細胞不同時間對存活率的影響Fig.1 The effect of corticosterone of different concentration on PC12 cell survival rate on different time

3 結果

3.1 不同濃度的皮質酮在不同時間對PC12損傷的MTT測定結果

實驗結果顯示皮質酮對PC12細胞的損傷程度隨濃度和時間呈依賴性上升，10 μmol/L和 100 μmol/L濃度的CORT作用PC12細胞12 h時，其細胞存活率分別為94.3%和89.8%，作用24 h后分別下降為92.6%和86.9%，至48 h后，其細胞存活率72.6%和47.5%。詳見圖1。因此，本研究中采用100 μmol/L CORT作用48 h建立PC12損傷模型。

3.2 木豆葉醇提物對皮質酮誘導PC12細胞形態的影響

形態學結果顯示，100 μmol/L的皮質酮與PC12細胞孵育48 h后，細胞形態發生了顯著的變化，表現為突起斷裂，包膜不完整，胞體膨脹，胞核固縮(詳見圖2a，2b);再加入不同濃度的木豆葉醇提物對細胞損傷有一定的逆轉作用(詳見圖2c，2d)。

圖2 木豆葉粗提物對皮質酮誘導的PC12細胞神經毒性的保護作用形態學觀察(×40)Fig.2 Protective effect of alcohol extract of C.cajan on conticosterone-induced lesion in cultured PC12 cells morphological observation(×40)

3.3 木豆葉醇提物及不同組份對皮質酮損傷的PC12細胞存活力影響

MTT結果顯示木豆葉醇提物、石油醚洗脫部位和乙酸乙酯洗脫部位在100～12.5 mg/L對皮質酮損傷的細胞表現出明顯的保護作用，50 mg/L達到最大值;二氯甲烷部位在50～12.5 mg/L有明顯的保護作用;而乙醇部位在200～12.5 mg/L均表現出明顯的活性且其活性的大小有明顯的劑量依賴關系。然而，高濃度(200 mg/L)的木豆葉醇提物、石油醚部位、二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位對細胞產生明顯的毒性作用。詳見表1。

表1 木豆葉醇提物及不同組分對皮質酮損傷PC12細胞的保護作用(n=5)Table 1 Protective effect of the alcohol extract and its fractions from C.cajan on corticosterone-induced lesion in cultured PC12 cells(n=5)

25 0.5526±0.0182 12.5 0.5308±0.0382

3.4 LDH活性的測定

乳酸脫氫酶(LDH)釋放法，進一步證實木豆葉醇提物及不同組分對皮質酮損傷的PC12有細胞保護作用。木豆葉醇提物100～12.5 mg/L、石油醚部位50～12.5 mg/L、二氯甲烷部位50～12.5 mg/L、乙酸乙酯部位50～12.5 mg/L和乙醇部位100～50 mg/L處理24 h，能顯著的降低了LDH的釋放率，結果見圖3。

圖3 木豆葉醇提物及不同組分對皮質酮誘導的PC12細胞LDH釋放率的影響(n=5)Fig.3 The effect of the alcohol extract and its fractions from C.cajan on LDH level of corticosterone-induced PC12 cells on different concentrations(n=5)

4 討論

本研究采用高濃度皮質酮損傷體外培養的PC12細胞，模擬慢性心理應激抑郁時糖皮質激素升高的狀態作為抗抑郁藥的篩選模型。結果表明，當皮質酮濃度為100 μmol/L，作用48 h，PC12細胞生長狀態差，懸浮細胞明顯增多，細胞存活率低于正常細胞，可以在一定程度上體現抑郁模型的病理特征。

本研究采用皮質酮損傷的PC12作為篩選模型，以MTT和LDH兩種方法檢測，研究木豆葉醇提物及不同組分對細胞損傷的保護作用，結果表明在濃度(50 mg/L)各個部位不但能逆轉皮質酮對PC12細胞造成的損傷，且能促進細胞的增殖，并且發現醇提物的活性最好。

木豆葉主要含芪類和黃酮類化合物［7，8］。而芪類化合物主要含木豆素、木豆素A、木豆素C等脂溶性成分，黃酮類化合物以木犀草苷、牡荊苷等水溶性成分為主。本研究石油醚洗脫部位、二氯甲烷洗脫部位和乙酸乙酯洗脫部位主要含芪類等脂溶性成分，而乙醇部位以水溶性黃酮為主。近年來研究表明，芪類化合物具有抗骨質疏松、降血脂和改善阿爾茨海默病(Alzheimer Disease，AD)模型大、小鼠的學習記憶能力和對神經細胞的保護作用［5］，黃酮類化合物還具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗感染、抗抑郁等作用［9，10］。本研究結果也表明木豆葉的芪類和黃酮類可能都對皮質酮損傷的PC12細胞均有保護作用。而醇提物中既含有芪類成分，又含有黃酮類成分，可能由于各有效成分間的協同作用，表現出更好的效果。

1 Barden N.Modulation of glucocorticoid receptor gene expression by antidepressant drugs.Pharmacopsychiatry，1996，29: 1.

2 Huang WC(黃文超)，Li YF(李云峰)，Luo ZP(羅質璞).The protective effect of monoamine transmitters on the cultured PC12 cells lesioned corticosterone.Chin Pharm Bull (中國藥理學通報)，2003，19:103-106.

3 Anderson DJ，Michelsohn A.Role of glucocorticoids in the chromaffin-neuron developmental decision.Int J Dev Neurosci，1989，7:475-483.

4 Li YF，Liu YQ，Huang WC，et al.Cytoprotective effect is one of common action pathways for antidepressants.Acta Pharm Sin，2003b，10:996-1000.

5 Ruan CY(阮燦軍).The mechanism study of trans-2，4-dimethoxystibene(S3)anti-Alzheimer's disease in animal model.Beijing:Institute of Basic Medical Sciences Chinese A-cademy of Medical Sciences School of Basic Medicine Peking Union Medical College(北京協和醫學院基礎醫學院)，PhD.2009.

6 Huang GY(黃桂英)，Liao XZ(廖雪珍)，Liao HF(廖惠芳)，et al.Studies on Water-soluble Extracts from Cajanus cajan leaf against hypoxic-ischemic brain damage.Tradit Chin Drug Res Clin Pharm(中藥新藥與臨床藥理)，2006，17:172-175.

7 Chen DH(陳迪華)，Li HY(李慧穎)，Lin G(林庚).Study on chemical constituents of leaves of Cajanus cajan(L)Millsp.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，1985，16:134-137.

8 Li L(林勵)，Xie N(謝寧)，Cheng ZH(程紫驊).Flavonoids from Cajanus cajan L..J Chin Pharm Univ(中國藥科大學學報)，1999，30:21-23.

9 Kim HK，Cheon BS，Kim YH，et al.Effects of natural occurring flavonoids on nitric oxide production in the macrophage cell line RAW264.7 and their structure-activity relationship.Biochem Phannacol，1999，58:759-765.

10 Matsuda H，Morikawa T，Ando S，et al.Structural requirement of flavonoids for nitric oxide produetion inhibitory activity and mechanism of action.Bioorg Med Chem，2003，11:1995-2000.