白菜葉片揮發(fā)成分多樣性及對黑斑病菌孢子萌發(fā)的影響

萬秀娟，范黎明，葉 敏，趙 艷，王 亮

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室，昆明 650201

白菜(Beassica pekinensis)屬十字花科蕓薹屬蕓薹種，是我國北方冬季的主要蔬菜。近年來，隨著白菜黑斑病的逐漸流行，白菜的質(zhì)量和產(chǎn)量受到了嚴(yán)重的影響。已有研究表明植物揮發(fā)性成分，對植食性昆蟲和植物抗病均有一定影響［1-4］。甜脆綠、瓢兒白、83-1和優(yōu)早四號是云南省常見的四個栽培品種，經(jīng)過田間觀察發(fā)現(xiàn)，栽培于同一地塊的四個白菜品種，對白菜黑斑病的抗病性表現(xiàn)出顯著差異。室內(nèi)人工接種試驗表明，接種后四個品種白菜發(fā)病的病情指數(shù)為83-1＞優(yōu)早四號＞甜脆綠＞瓢兒白，該實驗結(jié)果與田間觀察到的結(jié)果一致。本文通過使用GC-MS聯(lián)用技術(shù)和懸滴培養(yǎng)法，研究了4種不同品種白菜的葉面揮發(fā)性成分對白菜黑斑病菌孢子萌發(fā)的影響。研究結(jié)果對利用農(nóng)業(yè)生物多樣性控制作物病害的原理，指導(dǎo)白菜黑斑病的防治，具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試白菜:兩個抗病品種甜脆綠和瓢兒白;兩個感病品種83-1和優(yōu)早四號種子(均購于昆明市官渡區(qū)佰利種子園)經(jīng)10%次氯酸鈉消毒催芽后，播種于無蟲網(wǎng)室的苗盤中，統(tǒng)一肥水管理。

供試病原菌 白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)為云南省植物病理重點實驗室保藏菌種。

1.2 實驗方法

分別選取9～10葉期的四個健康白菜品種去根稱取300 g，分置在盛有40 mL重蒸正己烷的12 cm培養(yǎng)皿中漂洗2 min后收集漂洗液［5］，經(jīng)無水硫酸鈉(A.R，上海化學(xué)試劑一廠)脫水后過濾，用氮吹以400 mL·min-1的流速濃縮至0.6 mL，制備所得漂洗液密封保存于-20℃的冰箱中。

分別吸取上述四種白菜漂洗液1、5、10、15、20 μL(15 μL以下的漂洗液分別加重蒸正己烷定溶至20 μL)，用含有1%葡萄糖和0.5‰的吐溫-20的無菌蒸餾水，制成濃度為1×106個·mL-1的孢子懸浮液，采用懸滴培養(yǎng)法［6］，3 h后測定白菜漂洗物對孢子萌發(fā)的抑制率(孢子萌發(fā)已超過孢子長度1/2為準(zhǔn))，在20 μL重蒸正己烷中加入與處理相同的葡萄糖和吐溫-20作為溶劑對照，在20 μL滅菌蒸餾水中加入與處理相同的葡萄糖和吐溫-20作為空白對照，實驗重復(fù)3次。

孢子萌發(fā)率和抑制率的計算公式:

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析條件

Agilent 6890/5975型氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司)，NIST 05譜庫。色譜條件:HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司);程序升溫:初溫35℃，保持2 min，以4℃· min-1升至200℃后10℃·min-1升至250℃，保持10 min;載氣為高純氦氣(99.999%，昆明梅賽爾氣體有限公司)，流速1.0 mL·min-1;無分流進樣，進樣量1.0 μL。質(zhì)譜條件:EI離子源，電子能量70 eV，掃描范圍50－550 amu，四極桿溫度150℃，離子源溫度230℃，接口溫度280℃，EM電壓1400 V，溶劑延遲6.0 min。面積歸一化法計算各成分相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)合Student-Newman-Keuls檢驗進行單向ANOVA分析，比較不同處理間數(shù)據(jù)的差異顯著性和重復(fù)間的離散度。

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜揮發(fā)物化學(xué)成分分析

應(yīng)用GC-MS技術(shù)對四種白菜漂洗物進行化學(xué)成分分析，四種白菜漂洗物的總離子流圖(圖1-4)。四種白菜漂洗物中共檢測出14種揮發(fā)性組分，甜脆綠、瓢兒白、83-1和優(yōu)早四號漂洗物中揮發(fā)性成分分別為10種、7種、8種和7種。其中甜脆綠漂洗物中的主要揮發(fā)性成分為2，2，4，6，6-五甲基庚烷，相對含量為17.15%;瓢兒白、83-1和優(yōu)早四號漂洗物中的主要揮發(fā)性成分為反-3-己烯醇，相對含量分別為15.76%、10.87%、7.21%。2，4，6，8-四甲基十一碳烯和2，4，6-Tritert-butyl-4-methyl-2，5-cyclohexadien-1-one僅在83-1漂洗物中檢測到;2，4-二甲基-1-庚烯、反-2-己烯醛、2，2，4，4-四甲基辛烷和3，5-二甲基辛烷僅在甜脆綠漂洗物中檢測到。6，6-二甲基富烯、2，2，4，6，6-五甲基庚烷、1，3，8-對-薄荷三烯和1，2-二乙基苯為四種白菜所共有(表1)。

圖3 83-1漂洗物葉面總離子流圖Fig.3 TIC of 83-1 leaf surface rinse

圖4 優(yōu)早四號葉面漂洗物總離子流圖Fig.4 TIC of You zao si hao leaf surface rinse

表1 不同白菜品種揮發(fā)性組分及其相對含量Table 1 Volatile compounds and their relative percentage contents from different variety of Chinese cabbage rinses

圖5 四種白菜漂洗物主要揮發(fā)性組分相對含量的比較Fig.5 The relative percentage contents of main volatile compounds form different variety of Chinese cabbage rinses

順-3-己烯醛在甜脆綠漂洗物中的相對百分含量顯著高于其在其它三種白菜漂洗物中的相對百分量;反-3-己烯醇在瓢兒白漂洗物中的相對百分含量顯著高于其在其它白菜漂洗物中的相對百分含量。2，2，4，6，6-五甲基庚烷在甜脆綠漂洗物中的相對百分含量顯著高于其在其它三種白菜漂洗物中的相對百分含量;1，3，8-對-薄荷三烯和1，2-二乙基苯的相對百分含量在甜脆綠、瓢兒白和優(yōu)早四號漂洗物中無顯著性差異(圖5)。

2.2 白菜葉面漂洗物對鏈格孢菌孢子萌發(fā)的影響

溶劑對照組的病原孢子在培養(yǎng)3 h后，孢子萌發(fā)率大于96%，與空白對照相比無顯著差異(P＞0.05)。試驗結(jié)果表明，相同濃度的不同品種白菜葉面漂洗物，對黑斑病菌孢子萌發(fā)的影響差異顯著(P＜0.05);相同品種的白菜葉面漂洗物，其濃度與病原菌孢子萌發(fā)抑制率成正相關(guān)，經(jīng)不同濃度葉面漂洗物處理的病原菌孢子，其萌發(fā)抑制率間差異顯著(P＜0.05)，其中濃度為20 μL的瓢兒白葉面漂洗物，對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率最高。4個品種不同濃度的葉面漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制活性，如圖6所示。

圖6 4個品種不同濃度的白菜葉面漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of four variety Chinese cabbage leave surface rinses to A.brassicae spore germination at different concentrations

當(dāng)濃度為1 μL時，各品種漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率均無顯著差異(P＞0.05)，當(dāng)濃度大于10 μL時，四種白菜漂洗物對病原菌孢子的抑制率低依次排列為:瓢兒白＞甜脆綠＞優(yōu)早四號＞83-1，且各品種漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率表現(xiàn)出顯著差異(P＜0.05)。瓢兒白漂洗物在濃度為5 μL時，對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率為60%，而甜脆綠和優(yōu)早四號漂洗物則分別要濃度為15 μL和20 μL，對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率才能達到瓢兒白漂洗物5 μL的水平，瓢兒白漂洗物在20 μL濃度下，對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率超過90%。

圖7 不同品種白菜葉面漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of different variety Chinese cabbage leave surface rinses to A.brassicae spore germination at concentration of 15 μL

3 討論與結(jié)論

植物揮發(fā)性物質(zhì)對植物病原真菌的影響已有報道，廣玉蘭葉乙醇提取物以及其不同溶劑萃取層對植物病原真菌有抑制作用［7］，西班牙櫻桃葉的甲醇和乙醇提取物對多種病原真菌都有明顯的抑制作用［8］。本研究結(jié)果表明:采用漂洗的方法得到的四種白菜葉面的漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，這與前人發(fā)現(xiàn)的揮發(fā)性物質(zhì)對病原菌有抑制作用的研究結(jié)果相一致。

對四種白菜葉面漂洗物進行成分分析，共檢測到14種化合物，初步鑒定了13種，其中醛類、烯類、醇類、烷烴和酮類共12種。主要化合物有反-2-己烯醛和反-3-己烯醇，該結(jié)果與吳春燕［9］等人在對12種大白菜進行的檢測所得到的相對含量較高的組分為2-己烯醛、3-己烯醇(Z/E)的結(jié)果相一致。

本研究結(jié)果表明:四種白菜漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)均有抑制作用，高濃度時四種白菜葉面漂洗物對病原菌抑制活性的順序為:瓢兒白＞甜脆綠＞優(yōu)早四號＞83-1，且各品種漂洗物對孢子萌發(fā)的抑制率存在顯著差異。

在4種白菜漂洗物中，相同濃度時，瓢兒白漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率最高，經(jīng)GC-MS檢測分析瓢兒白漂洗物中含有的反-3-己烯醇含量顯著高于其它三種白菜漂洗物。Croft研究表明，在菜豆受假單孢菌侵染時，抗病植株中的反-2-己烯醛、反-3-己烯醇的含量是易感病植株的17和16倍［10］。而瓢兒白漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率顯著高于其它三種白菜漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率，這可能與其含有的反-3-己烯醇有關(guān)。甜脆綠漂洗物中檢測到反-2-己烯醛，而在其它三種白菜漂洗物中均未檢測到，有報道表明反-2-己烯醛對植物病原菌有抑制作用，如番茄葉釋放的揮發(fā)物質(zhì)反-2-己烯醛、己烯醛、反-2-壬烯醛、壬烯醛2-蒈烯和檸檬烯對病原真菌鏈格孢菌及灰葡萄孢菌均有一定的抑制作用［11，6］，反-2-己烯醛還可以降低梨青霉病的發(fā)病［12］。而甜脆綠漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率顯著高于83-1和優(yōu)早四號漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率，這可能與其含有反-2-己烯醛有關(guān)。

順-3-己烯醛在甜脆綠漂洗物中的含量顯著高于其在其它三種白菜漂洗物，而在高濃度條件下，瓢兒白漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率顯著高于其它三種白菜漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率，說明該化合物可能與抑制黑斑病菌孢子萌發(fā)無關(guān)。2，4-二甲基-1-庚烯、2，2，4，4-四甲基辛烷和3，5-二甲基辛烷三種組分僅在甜脆綠漂洗物中檢測到;而在高濃度時，甜脆綠漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率顯著高于83-1和優(yōu)早四號漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率，說明這三種化合物是抑制孢子萌發(fā)的疑似化合物。2，4，6，8-四甲基十一碳烯和2，4，6-Tritert-butyl-4-methyl-2，5-cyclohexadien-1-one兩種揮發(fā)性組分僅在感病品種83-1漂洗物中檢測到，而83-1漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率顯著低于其它三種白菜漂洗物對黑斑病孢子萌發(fā)的抑制率，說明這兩種化合物可能與誘導(dǎo)黑斑病菌孢子萌發(fā)有關(guān)。

6，6-二甲基富烯、2，2，4，6，6-五甲基庚烷、1，3，8-對-薄荷三烯和1，2-二乙基苯為四種白菜所共有。6，6-二甲基富烯在甜脆綠和瓢兒白漂洗物中的含量與在83-1和優(yōu)早四號漂洗物中的含量均無顯著差異，而在高濃度時，甜脆綠和瓢兒白漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率顯著高于83-1和優(yōu)早四號漂洗物對黑斑病孢子萌發(fā)的抑制率，說明這四種白菜漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的影響可能與該物質(zhì)無關(guān)。1，3，8-對-薄荷三烯和1，2-二乙基苯在瓢兒白漂洗物中的含量與其在83-1漂洗物中的含量無顯著性差異，而在高濃度時，瓢兒白漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率顯著高于83-1漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率，說明1，3，8-對-薄荷三烯和1，2-二乙基苯兩種化合物可能與抑制黑斑病菌孢子萌發(fā)無關(guān)。2，2，4，6，6-五甲基庚烷在甜脆綠漂洗物中的含量顯著高于在其他三種白菜漂洗物中的含量，而甜脆綠漂洗物對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率也顯著高于83-1和優(yōu)早四號漂洗物對該病孢子萌發(fā)的抑制率，說明2，2，4，6，6-五甲基庚烷是抑制白菜黑斑病菌孢子萌發(fā)的疑似化合物。

因此，結(jié)合已有的研究報道，可推測各白菜漂洗物對黑斑病孢子萌發(fā)抑制率存在顯著性差異，可能與它們漂洗物中含有2，2，4，6，6-五甲基庚烷、反-3-己烯醇、反-2-己烯醛、2，4-二甲基-1-庚烯、2，2，4，4-四甲基辛烷、3，5-二甲基辛烷、2，4，6，8-四甲基十一碳烯和2，4，6-Tritert-butyl-4-methyl-2，5-cyclohexadien-1-one這幾種揮發(fā)性組分有關(guān)。但是，由于植物揮發(fā)性組分是復(fù)雜的混合物［4］，所以抑制白菜黑斑病菌孢子萌發(fā)的主要活性成分可能是某種化合物或某些化合物的集合，它們對白菜黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制效果是單獨作用還是協(xié)同作用，尚待進一步研究。

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