南瓜葉中γ-氨基丁酸的提取及薄層掃描測定

黃美娥，彭 勝，陳陽波，袁洪昆

1吉首大學林產化工工程湖南省重點實驗室;2吉首大學城鄉資源與規劃學院，張家界427000

南瓜(Cucurbita moschata Duch.)系葫蘆科南瓜屬一年生蔓生草本植物，種植歷史悠久，世界各地均有栽培［1］。南瓜性味甘溫，入脾胃二經，具有補中益氣、消炎止痛、解毒殺蟲等功效。對其功能成分如γ-氨基丁酸、葫蘆巴堿等的研究報道很多［2］。南瓜葉作為保健食品資源之一，資源豐富，天然無公害，但國內外關于從南瓜葉中提取γ-氨基丁酸的研究鮮有報道。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，簡稱GABA)，是一種重要的功能性非蛋白質氨基酸，參與體內的多種代謝活動，具有很高的生理活性。GABA在醫藥、食品、飼料中具有廣闊的應用前景，2009年9月 29日，GABA已被中華人民共和國衛生部批準為可用于食品生產加工的新資源，開發GABA產品及其功能性食品、保健品是當前食品及醫藥領域的研究熱點之一［3］。因此利用南瓜葉提取GABA，對充分利用南瓜資源具有重要的經濟意義和現實意義。本實驗通過對南瓜葉中GABA的提取測定進行研究，旨在為南瓜葉的進一步開發利用奠定基礎。

1 材料與方法［4-7］

1.1 材料、試劑與儀器

南瓜葉:于7月采集吉首大學張家界校區后山菜園鮮南瓜葉，置恒溫干燥箱中50℃干燥至恒重，粉碎過40目篩，保存，備用。

γ-氨基丁酸標準品:中國藥品生物制品檢定研究所，純度≥99%;薄層層析硅膠G、茚三酮、正丁醇、冰醋酸、無水乙醇等均為分析純。

日本島津CS-9000型薄層掃描儀、RE-540旋轉蒸發儀、WT-150粉碎機、CS101-3D電熱鼓風干燥箱、DSY-2-4孔電熱恒溫水浴鍋(北京國華醫療器械廠)、AEG-200十萬分之一天平。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的配制

精密稱取γ-氨基丁酸對照品25 mg置于25 mL容量瓶中，用20%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成1 mg/mL的對照品溶液，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備

稱取南瓜葉樣品粉末10.00 g，加入20%的乙醇溶液100 mL，浸提1 h，過濾，定容至100 mL，搖勻，制得南瓜葉供試品溶液，備用。

1.2.3 薄層色譜條件與薄層掃描條件［3］

稱取硅膠G 30 g放入研缽中，加入0.5%CMCNa和60 mL水調成糊狀后涂布于玻璃板(10 cm× 20 cm)上，厚度為0.5 mm，置室溫風干后于105℃活化1 h，置干燥器中備用。分別吸取5 uL的對照品溶液和供試品溶液點樣，用正丁醇、醋酸、水按4∶1∶1的比例配成展開劑，飽和后按上行方式展開。用0.2%茚三酮乙醇溶液噴霧顯色，105℃烘數分鐘，直至獲最大斑點，薄層掃描，根據薄層掃描結果確定南瓜葉中γ-氨基丁酸的薄層掃描條件為:反射式雙波長線式掃描，λs=515 nm，λr=680 nm，狹縫為1.0*10.0 mm，SX=1。

1.2.4 標準曲線的制備

稱取γ-氨基丁酸對照品100 mg用蒸餾水定容至100 mL，得1 mg/mL的γ-氨基丁酸對照品溶液。分別吸取1 mg/mL的γ-氨基丁酸對照品溶液，配成0.125、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/mL的系列對照溶液。于硅膠板上點樣，層析展開、顯色、薄層掃描，以對照溶液濃度為橫坐標(x)，峰面積積為縱坐標(y)，建立標準曲線，得回歸方程為y=77747x+ 4948.7，相關系數R2=0.9991。表明γ-氨基丁酸薄層掃描時濃度在0.125～2.0 mg/mL范圍內有較好的線性關系。

1.2.5 穩定性試驗

用毛細點樣管吸取對照品溶液5 μL點于薄層板上，按上述條件展開、顯色、薄層掃描，每隔30 min掃描1次，共測定5次，計算峰面積的RSD(n=5)為5.34%，RSD(n=4)為2.50%，表明顯色后在2 h內較穩定。

1.2.6 重復性試驗

用毛細點樣管吸取同一南瓜葉供試品溶液5 μL點樣，按上述條件展開、顯色、薄層掃描，重復掃描6次，結果RSD為0.98%。

1.2.7 精密度實驗

同板精密度試驗:用毛細點樣管吸取對照品溶液5 μL點樣(重復點6個點)，按上述條件展開、顯色、薄層掃描，結果RSD為1.99%。異板精密度試驗:用毛細點樣管吸取對照品溶液5 μL點于6塊薄層板上，按上述條件展開、顯色、依次掃描測定，結果RSD為2.13%。

1.2.8 加樣回收試驗

將對照品溶液5 μL，供試品溶液6 μL和對照品溶液5 μL，與供試品溶液3 μL的混合液分別點于同一薄層板上，按上述條件展開、顯色、掃描，測得平均回收率(n=4)為99.61%，RSD(n=4)為2.04%。

1.2.9 提取條件的確定

1.2.9.1 提取溶劑的選擇

稱取10.00 g南瓜葉粉末10份于三角瓶中，分別加入蒸餾水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇各100 mL，于常溫浸提1 h，過濾，濾渣重提1次，合并濾液;分別進行減壓濃縮、醇沉、過濾、濃縮，掃描測定。

1.2.9.2 提取時間的選擇

稱取10.00 g南瓜葉粉末10份于三角瓶中，加入20%乙醇100 mL，于常溫下分別浸提1、2、3、4、5 h，過濾，濾渣重提1次，合并濾液;減壓濃縮、醇沉、過濾、濃縮，掃描測定。

1.2.9.3 提取料液比的選擇

稱取10.00 g南瓜葉樣品10份于三角瓶中，分別加入20%乙醇80、100、120、140、160 mL，于常溫下浸提1 h，過濾，濾渣重提1次，合并濾液;減壓濃縮、醇沉、過濾、濃縮，掃描測定。

1.2.10 正交試驗

由單因素試驗確定的范圍，選擇乙醇濃度、固液比、提取時間三因素作為考察對象，每因素確定三個水平，進行正交試驗，因表水平見表1。

表1 正交試驗因素表Table 1 Orthogonal experiment facts

2 結果與分析

2.1 提取條件的單因素實驗確定

2.1.1 提取溶劑的選擇結果

按1.2.9.1進行提取測定，提取溶劑對南瓜葉中γ-氨基丁酸提取效果的影響結果為:以水和高濃度乙醇為提取溶劑比稀乙醇的提取效果差，以20%乙醇為提取溶劑進行提取實驗得γ-氨基丁酸含量值最高為156 mg/100 g，故選擇提取溶劑濃度的優化區為10%～30%。

2.1.2 提取時間的確定

按1.2.9.2進行提取測定，提取時間對南瓜葉中γ-氨基丁酸提取效果的影響結果為:隨著提取時間的延長，提取得到的γ-氨基丁酸的含量反而逐漸降低，提取時間為1 h進行提取實驗得γ-氨基丁酸含量值最高為148 mg/100 g，故選擇提取時間的優化區為0.5 h～1.5 h。

2.1.3 固液比的選擇

按1.2.9.3進行提取測定，提取料液比對南瓜葉中γ-氨基丁酸提取效果的影響結果為:隨料液比的增大，南瓜葉中γ-氨基丁酸的含量不斷提高，但料液比為1∶14～16時，增大料液比，含量增加放緩。所以，選擇料液比的優化區為1∶15～17。

2.2 正交實驗結果與分析

表2 正交試驗結果表(n=3)Table 2 The effects of orthogonal experiment(n=3)

表3 方差分析表Table 3 The variance analysis

對表2中數據進行方差分析，結果由表3可見，因素B顯著，因素A和C不顯著，因素作用的主次順序是B＞A＞C，即浸提時間＞溶劑濃度＞料液比，與極差分析得出的結果一致。對表2數據進行分析得出南瓜葉中γ-氨基丁酸提取條件最優水平組合為A2B2C3，即以20%乙醇為溶劑、浸提1 h、料液比1∶17，其γ-氨基丁酸的含量為209 mg/100 g。

2.3 驗證實驗

按上述最佳條件A2B2C3進行3次驗證提取試驗，測得南瓜葉中γ-氨基丁酸的含量分別為210、205、212 mg/100 g，平均含量209 mg/100 g。

3 結論

本研究采用單因素和正交試驗確定了南瓜葉中γ-氨基丁酸的提取條件，即精密稱取供試品適量，加入17倍體積的20%乙醇、常溫浸提1 h。并以薄層掃描法測定南瓜葉中γ-氨基丁酸的含量為209 mg/ 100 g，其方法操作簡單、靈敏，結果準確可靠。

1 Jiangsu New Medical College(江蘇新醫學院編).Dictionary of Chinese Materia Mediaca(中藥大詞典(上冊)).Shanghai:Shanghai Scientific＆Technical Publishers，1985.1555-1560，3225.

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3 Wei ZZ(魏珍珍)，Zhao M(趙明)，Li SR(李雙容)，et al.Study on feasibility of determination of GABA content in tea by colorimetric method.Acta Agric Jiangxi(江西農業學報)，2010，22(8):56-58.

4 Huang ME(黃美娥)，Yu HZ(于華忠)，Cao Y(曹庸).Extraction and determination of γ-aminobutyric acid in fern.A-mino Acids＆Biotic Resour(氨基酸與生物資源)，2004，27:77-78.

5 Deng K(鄧康)，Luo J(羅健).TLC scanning determination of 4 kinds of neurotransmitter in mouse brain.Northwest Pharm J(西北藥學雜志)，2000，15:150-151.

6 Zhao CQ(趙長琦)，Li GM(李廣民)，Wang J(王軍).TLC-densitometric determination of hypotensive constituent γ-aminobutyric acid in Hongqi.J Northwest Univ，Nat Sci(西北大學學報，自科版)，1995，6:277-278.

7 Pang MJ(逄敏潔)，Li DW(李多偉)，Wang YC(王義潮)，et al.TLC scanning determination of sclareol.Chin J Pharm Anal(藥物分析雜志)，2008，28:1554-1555.