響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取宣木瓜總皂苷提取工藝研究

潘國波，楊小明，丁 艷，李媛媛，韓邦興

1江蘇大學食品與生物生物工程學院;2江蘇大學化學化工學院;3江蘇大學藥學院，鎮(zhèn)江212013

薔薇科木瓜屬Chaenomeles Lindl，共約有5種，我國均產(chǎn)［1］。藥典記載的正品木瓜為貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai的近成熟果實，因燙曬干燥后皮面多皺褶，故又稱為皺皮木瓜。主產(chǎn)于安徽、浙江、湖北、四川等地，其中產(chǎn)于安徽宣城者質(zhì)量最佳，習稱宣木瓜。中醫(yī)認為宣木瓜可去濕除痹，是治療久風頑痹之要藥［2］?，F(xiàn)代醫(yī)學研究證明宣木瓜中主要藥效成分為皂苷類物質(zhì)，具有護肝降酶、抗炎、促免疫、抗菌、抗腫瘤等活性［3-8］。目前國內(nèi)對木瓜皂苷的提取通常采用乙醇溶劑浸提和超聲輔助回流提?。?］，超聲輔助回流提取較乙醇溶劑浸提能夠有效縮短提取時間，增加提取效率，但是尚沒有超聲輔助回流提取宣木瓜皂苷工藝的報道。因此，本文采用超聲輔助回流提取法提取宣木瓜皂苷，用響應(yīng)面法對各主要影響因子提取時間、溫度、乙醇濃度和料液比之間的單一和交互作用等進行了較深入的研究，得出最佳的提取工藝參數(shù)，為宣木瓜皂苷以后的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

宣木瓜，采購于安徽省宣城市，經(jīng)江蘇大學藥學院韓邦興教授鑒定為正品宣木瓜;齊墩果酸標準品，購自中國藥品生物制品檢定所，純度≧95%(批號110709-200304);無水乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸均為分析純。

分光光度計(VIS-7220);恒溫水浴鍋(HH-S型);電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG9140A型);冰箱(合肥榮事達電冰箱廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗對宣木瓜總皂苷提取條件的優(yōu)化

1.2.1.1 乙醇濃度對宣木瓜總皂苷得率的影響:準確稱取1.00 g宣木瓜干粉6份分別置于100 mL三角瓶中，固定提取時間30 min，提取溫度40℃，料液比1:30 g/mL，乙醇濃度依次40%、50%、60%、70%、80%、90%，超聲200 W，恒溫水浴提取。

1.2.1.2 料液比對宣木瓜總皂苷得率的影響:準確稱取1.00 g宣木瓜干粉5份分別置于100 mL三角瓶中，固定提取時間30 min，提取溫度40℃，乙醇濃度70%，料液比依次1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL，超聲200 W，恒溫水浴提取。

1.2.1.3 提取時間對宣木瓜總皂苷提取率的影響:準確稱取1.00 g宣木瓜干粉6份分別置于100 mL三角瓶中，固定溫度40℃，料液比1∶30 g/mL，乙醇濃度70%，提取時間依次為15、30、45、60、75、90 min，超聲200 W，恒溫水浴提取。

1.2.1.4 提取溫度對宣木瓜總皂苷提取率的影響:準確稱取1.00 g宣木瓜干粉6份分別置于100 mL三角瓶中，固定提取時間60 min，料液比1∶30 g/ mL，乙醇濃度 70%，提取溫度依次30、40、50、60、70、75℃，超聲200 W，恒溫水浴提取。

1.2.2 總皂苷含量測定香草醛高氯酸法

1.2.2.1 標準曲線的測定

按文獻［10］建立的宣木瓜總皂苷含量測定方法進行計算?；貧w方程為:y=0.0182x+0.0481，R2= 0.9949，線性范圍為0.016～0.12 mg/mL。

1.2.2.2 提取液中總皂苷含量的測定

將每次所得提取液，按照1.2.2.1分析方法處理后，用無水乙醇定容至100 mL。從中吸取適量，按標準曲線測定項測定方法進行總皂苷含量的測定。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)的處理均采用Design Expert 8.0.5軟件進行分析［11-13］。

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝設(shè)計與實驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，采用 Design-Expert 8.0.5統(tǒng)計分析軟件中Central Composite Design設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)分析實驗。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

提取溫度、料液比、提取時間和乙醇濃度對宣木瓜總皂苷得率的影響結(jié)果見表2。

應(yīng)用Design-Expert 8.0.5軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合。進行顯著性檢驗，結(jié)果見表3。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Independent variables and their levels used for Box-Behnken central composite design

表2 響應(yīng)面法設(shè)計與試驗結(jié)果Table 2 Box-Behnken central composite design for independent variables and their response

16 0 1 1 0 1.4363 17 -1 0 -1 0 1.3071 18 1 0 -1 0 1.4088 19 -1 0 1 0 1.3978 20 1 0 1 0 1.4555 21 0 -1 0 -1 1.4060 22 0 1 0 -1 1.3786 23 0 -1 0 1 1.4335 24 0 1 0 1 1.3950 25 0 0 0 0 1.5626 26 0 0 0 0 1.5544 27 0 0 0 0 1.5434

提取溫度(X1)、液料比(X2)、提取時間(X3)和乙醇濃度(X4)與皂苷得率之間的二次多項回歸方程:

表3 回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗Table 3 Analysis of mean square deviation of regress equation and significant test

回歸方差分析顯著性檢驗表明，提取溫度、提取時間兩因素對皂苷得率的線性效應(yīng)最顯著;提取溫度和乙醇濃度因子間交互作用比較明顯。在本實驗設(shè)計范圍內(nèi)，該模型回歸顯著(P＜0.0005)。模型的復相關(guān)系數(shù)為 0.9153，說明該模型能解釋91.53%響應(yīng)值的變化，即該模型與實際實驗擬合良好，試驗誤差小，證明應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化的提取工藝提取宣木瓜總皂苷是可行的。

2.2 宣木瓜皂苷提取率的響應(yīng)曲面分析和優(yōu)化

由圖1可直觀地看出提取溫度和乙醇濃度的交互作用較顯著。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。

對回歸方程求導，并令其等于零，可以得到曲面的最大點，即三個主要因素的最佳水平值，分別為: X1=0.23、X2=0.06、X3=0.17、X4=0.05，轉(zhuǎn)換后得到提取的最佳條件為:溫度62.34℃、料液比1: 30.57 g/mL、乙醇濃度 70.49%、提取時間61.69 min，其相對應(yīng)的皂苷含量為1.56%。

圖1 各因素交互作用對總皂苷得率的影響Fig.1 Correlative effects of different factors on triterpenoid saponins yield

2.3 模型響應(yīng)值的驗證

為了檢測試驗結(jié)果是否與真實情況相一致，根據(jù)以上試驗結(jié)果進行近似驗證實驗，考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為溫度60.00℃、料液比1:30.00 g/mL、乙醇濃度70.00%、提取時間60.00 min，其相對應(yīng)的皂苷含量為1.55%，與理論預測值相比，其相對誤差約為0.65%，因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件準確可靠，具有使用價值。

2.4 超聲波輔助提取和熱醇回流提取法的比較

將篩選出來的最優(yōu)工藝與傳統(tǒng)熱醇回流提取法進行比較，提取條件和宣木瓜總皂苷得率見表4。

表4 不同提取方法對總皂苷得率的影響Table 4 Effect of different extraction methods on triterpenoid saponins yield

3 結(jié)論

本實驗在單因素試驗的方法上，采用響應(yīng)面試驗設(shè)計方法對超聲輔助提取宣木瓜總皂苷的工藝進行優(yōu)化。實驗得到的模型的回歸模型顯著，失擬誤差不顯著，說明通過本實驗所建立的二次回歸方程能較好地描述各因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系。依據(jù)回歸分析結(jié)果得到的宣木瓜總皂苷的提取條件為:溫度62.34℃、料液比 1∶30.57 g/mL、乙醇濃度70.49%、提取時間61.69 min，在此條件下得到的預測提取率為1.55%，跟實際值基本一致。

超聲輔助提取技術(shù)不僅操作簡便，所需時間短，提取溫度低，而且皂苷提取率較高，還能避免中藥有效成分在提取過程中被破壞，效果較理想，因此在中藥制劑的提取工藝中運用越來越受到重視。通過與熱醇回流提取法的比較，超聲輔助提取的皂苷得率提高了近25%，說明超聲輔助提取技術(shù)能夠有效地提高宣木瓜皂苷的得率，為宣木瓜皂苷以后的研究提供參考。

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