響應面法優化超聲輔助提取宣木瓜總皂苷提取工藝研究

潘國波，楊小明，丁 艷，李媛媛，韓邦興

1江蘇大學食品與生物生物工程學院;2江蘇大學化學化工學院;3江蘇大學藥學院，鎮江212013

薔薇科木瓜屬Chaenomeles Lindl，共約有5種，我國均產［1］。藥典記載的正品木瓜為貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai的近成熟果實，因燙曬干燥后皮面多皺褶，故又稱為皺皮木瓜。主產于安徽、浙江、湖北、四川等地，其中產于安徽宣城者質量最佳，習稱宣木瓜。中醫認為宣木瓜可去濕除痹，是治療久風頑痹之要藥［2］。現代醫學研究證明宣木瓜中主要藥效成分為皂苷類物質，具有護肝降酶、抗炎、促免疫、抗菌、抗腫瘤等活性［3-8］。目前國內對木瓜皂苷的提取通常采用乙醇溶劑浸提和超聲輔助回流提取［9］，超聲輔助回流提取較乙醇溶劑浸提能夠有效縮短提取時間，增加提取效率，但是尚沒有超聲輔助回流提取宣木瓜皂苷工藝的報道。因此，本文采用超聲輔助回流提取法提取宣木瓜皂苷，用響應面法對各主要影響因子提取時間、溫度、乙醇濃度和料液比之間的單一和交互作用等進行了較深入的研究，得出最佳的提取工藝參數，為宣木瓜皂苷以后的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

宣木瓜，采購于安徽省宣城市，經江蘇大學藥學院韓邦興教授鑒定為正品宣木瓜;齊墩果酸標準品，購自中國藥品生物制品檢定所，純度≧95%(批號110709-200304);無水乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸均為分析純。

分光光度計(VIS-7220);恒溫水浴鍋(HH-S型);電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG9140A型);冰箱(合肥榮事達電冰箱廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗對宣木瓜總皂苷提取條件的優化

1.2.1.1 乙醇濃度對宣木瓜總皂苷得率的影響:準確稱取1.00 g宣木瓜干粉6份分別置于100 mL三角瓶中，固定提取時間30 min，提取溫度40℃，料液比1:30 g/mL，乙醇濃度依次40%、50%、60%、70%、80%、90%，超聲200 W，恒溫水浴提取。

1.2.1.2 料液比對宣木瓜總皂苷得率的影響:準確稱取1.00 g宣木瓜干粉5份分別置于100 mL三角瓶中，固定提取時間30 min，提取溫度40℃，乙醇濃度70%，料液比依次1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL，超聲200 W，恒溫水浴提取。

1.2.1.3 提取時間對宣木瓜總皂苷提取率的影響:準確稱取1.00 g宣木瓜干粉6份分別置于100 mL三角瓶中，固定溫度40℃，料液比1∶30 g/mL，乙醇濃度70%，提取時間依次為15、30、45、60、75、90 min，超聲200 W，恒溫水浴提取。

1.2.1.4 提取溫度對宣木瓜總皂苷提取率的影響:準確稱取1.00 g宣木瓜干粉6份分別置于100 mL三角瓶中，固定提取時間60 min，料液比1∶30 g/ mL，乙醇濃度 70%，提取溫度依次30、40、50、60、70、75℃，超聲200 W，恒溫水浴提取。

1.2.2 總皂苷含量測定香草醛高氯酸法

1.2.2.1 標準曲線的測定

按文獻［10］建立的宣木瓜總皂苷含量測定方法進行計算?；貧w方程為:y=0.0182x+0.0481，R2= 0.9949，線性范圍為0.016～0.12 mg/mL。

1.2.2.2 提取液中總皂苷含量的測定

將每次所得提取液，按照1.2.2.1分析方法處理后，用無水乙醇定容至100 mL。從中吸取適量，按標準曲線測定項測定方法進行總皂苷含量的測定。

1.2.3 數據分析

試驗數據的處理均采用Design Expert 8.0.5軟件進行分析［11-13］。

2 結果與討論

2.1 響應面分析法優化工藝設計與實驗結果

根據單因素實驗的結果，采用 Design-Expert 8.0.5統計分析軟件中Central Composite Design設計四因素三水平的響應分析實驗。試驗因素與水平設計見表1。

提取溫度、料液比、提取時間和乙醇濃度對宣木瓜總皂苷得率的影響結果見表2。

應用Design-Expert 8.0.5軟件對表2中的數據進行多元回歸擬合。進行顯著性檢驗，結果見表3。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Independent variables and their levels used for Box-Behnken central composite design

表2 響應面法設計與試驗結果Table 2 Box-Behnken central composite design for independent variables and their response

16 0 1 1 0 1.4363 17 -1 0 -1 0 1.3071 18 1 0 -1 0 1.4088 19 -1 0 1 0 1.3978 20 1 0 1 0 1.4555 21 0 -1 0 -1 1.4060 22 0 1 0 -1 1.3786 23 0 -1 0 1 1.4335 24 0 1 0 1 1.3950 25 0 0 0 0 1.5626 26 0 0 0 0 1.5544 27 0 0 0 0 1.5434

提取溫度(X1)、液料比(X2)、提取時間(X3)和乙醇濃度(X4)與皂苷得率之間的二次多項回歸方程:

表3 回歸方程系數及其顯著性檢驗Table 3 Analysis of mean square deviation of regress equation and significant test

回歸方差分析顯著性檢驗表明，提取溫度、提取時間兩因素對皂苷得率的線性效應最顯著;提取溫度和乙醇濃度因子間交互作用比較明顯。在本實驗設計范圍內，該模型回歸顯著(P＜0.0005)。模型的復相關系數為 0.9153，說明該模型能解釋91.53%響應值的變化，即該模型與實際實驗擬合良好，試驗誤差小，證明應用響應曲面法優化的提取工藝提取宣木瓜總皂苷是可行的。

2.2 宣木瓜皂苷提取率的響應曲面分析和優化

由圖1可直觀地看出提取溫度和乙醇濃度的交互作用較顯著。等高線的形狀可反映出交互效應的強弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。

對回歸方程求導，并令其等于零，可以得到曲面的最大點，即三個主要因素的最佳水平值，分別為: X1=0.23、X2=0.06、X3=0.17、X4=0.05，轉換后得到提取的最佳條件為:溫度62.34℃、料液比1: 30.57 g/mL、乙醇濃度 70.49%、提取時間61.69 min，其相對應的皂苷含量為1.56%。

圖1 各因素交互作用對總皂苷得率的影響Fig.1 Correlative effects of different factors on triterpenoid saponins yield

2.3 模型響應值的驗證

為了檢測試驗結果是否與真實情況相一致，根據以上試驗結果進行近似驗證實驗，考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為溫度60.00℃、料液比1:30.00 g/mL、乙醇濃度70.00%、提取時間60.00 min，其相對應的皂苷含量為1.55%，與理論預測值相比，其相對誤差約為0.65%，因此，采用響應面法優化得到的提取條件準確可靠，具有使用價值。

2.4 超聲波輔助提取和熱醇回流提取法的比較

將篩選出來的最優工藝與傳統熱醇回流提取法進行比較，提取條件和宣木瓜總皂苷得率見表4。

表4 不同提取方法對總皂苷得率的影響Table 4 Effect of different extraction methods on triterpenoid saponins yield

3 結論

本實驗在單因素試驗的方法上，采用響應面試驗設計方法對超聲輔助提取宣木瓜總皂苷的工藝進行優化。實驗得到的模型的回歸模型顯著，失擬誤差不顯著，說明通過本實驗所建立的二次回歸方程能較好地描述各因素和響應值之間的關系。依據回歸分析結果得到的宣木瓜總皂苷的提取條件為:溫度62.34℃、料液比 1∶30.57 g/mL、乙醇濃度70.49%、提取時間61.69 min，在此條件下得到的預測提取率為1.55%，跟實際值基本一致。

超聲輔助提取技術不僅操作簡便，所需時間短，提取溫度低，而且皂苷提取率較高，還能避免中藥有效成分在提取過程中被破壞，效果較理想，因此在中藥制劑的提取工藝中運用越來越受到重視。通過與熱醇回流提取法的比較，超聲輔助提取的皂苷得率提高了近25%，說明超聲輔助提取技術能夠有效地提高宣木瓜皂苷的得率，為宣木瓜皂苷以后的研究提供參考。

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