環磷酰胺在動物模型體內抗腫瘤影響及抑瘤機制的研究

遲淑萍 白冰珂 謝 進 陳紅鴿 杜 麗 由莉越 程 云

解放軍302醫院藥學部，北京 100039

腫瘤目前是危害人類健康的主要疾病，環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）作為一種抗癌譜廣、療效較好的抗癌藥物，已廣泛應用于臨床。由于該藥物的良好抗癌性能，尤其是具有對癌細胞與正常細胞殺傷力差別很大這一特性，使得其在臨床得到了廣泛應用。環磷酰胺在細胞水平以及聯合用藥等方面的研究較多[1-2]，目前腫瘤化療所應用的大多數藥物，都經移植性動物腫瘤試驗而被發現，并以此為模型進行疾病發生機制和藥物篩選的研究，因此它是篩選抗腫瘤新藥中最常用的模型[3]，對研究腫瘤的病因、發病機制、抗癌藥物篩選及腫瘤防治等都具有非常重要的意義[4]。現階段進行的抗癌藥物動物實驗研究過程中，多采用環磷酰胺作為陽性對照藥物，然而，關于環磷酰胺是否具有調節腫瘤相關基因表達而發揮抗腫瘤作用，尚鮮有人報道。本研究旨在通過建立動物模型（腹水瘤模型和移植性S180肉瘤實體小鼠模型），觀察腫瘤各相關基因在環磷酰胺藥物上的表達情況以及觀察環磷酰胺抑制腫瘤的作用，以期進一步對環磷酰胺抑瘤機制作更深一步探討，為研究抗腫瘤動物模型中陽性對照藥物提供實驗數據因而發揮更好的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康昆明系小鼠，清潔級：2級，體質量為18～22 g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，合格證號：scxk-（軍）2007-004，飼料符合GB14924-94《實驗動物全價營養飼料》標準。

1.2 試藥

環磷酰胺：山西普德藥業有限公司（批號20070310）；小鼠血管內皮細胞生長因子酶免試劑盒（VEGF Elisa Kit）：上海碧云天生物技術研究所；BCA蛋白定量試劑盒：Thermo（批號：JL128100）；液體石蠟油：上海生工生產（生產批號：0110502）；羧甲 基纖維 素鈉溶液（CMC）（貨 號：CDCU-1096553）上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 瘤株

小鼠肉瘤細胞S180，腹水型，鼠源性H22肝癌細胞，由302醫院中藥研究所惠贈。

1.4 儀器

電子天平：梅特勒-托利多常州稱重舍妹系統有限公司制造（型號：SPN202F）；酶聯儀：北京新風機電技術公司制造（型號：ZS-3）。

1.5 方法

1.5.1 建立動物模型 取健康昆明系小鼠10只，雌雄各半，腹腔注射液體石蠟油0.5 mL/只，1周后，分別小鼠腹腔接種S180和H22細胞，生理鹽水（NS）將其細胞密度調整為2×106/mL，腹腔注射0.5 mL/只，1周后，小鼠腹部漲大按之有波動感，繼之將其斷頸處死，取出腹水（無菌條件），調整細胞密度為2×107/mL（用RPMI1640培養基洗2次后），分別制成細胞懸液，小鼠右腋皮下接種S180細胞懸液0.1 mL/只（除外對照組），制成局灶型實體瘤模型；小鼠腹腔接種H22細胞懸液0.2 mL/只（除外對照組），建立腹水瘤模型[5]。

1.5.2 實驗分組及給藥方法 健康昆明系小鼠60只，每組10只，雌雄分盒，排除體重差距大、質量不合格動物，適應性飼養觀察1 d后，隨機分為六組，即實體瘤模型分為三組：對照組、模型組、環磷酰胺組。對照組給予NS灌胃0.5 mL/只，模型組給予等量1%羧甲基纖維素鈉（CMC）溶液灌胃，環磷酰胺組隔日腹腔注射環磷酰胺注射液0.02 g/（kg·d）[6]，0.1 mL/只，連續給藥15 d。腹水瘤模型分為三組：對照組、模型組、環磷酰胺組。小鼠末次腹腔接種給藥15 d后，按常規繼續飼養，觀察其存活時間，每天量腹圍、稱重，直至模型組小鼠全部死亡。實驗重復3次。

1.5.3 制備腫瘤瘤體 實體瘤模型小鼠連續接種瘤細胞15 d，末次給藥后24 h，測量體重，頸椎脫臼處死，解剖小鼠，剝離瘤體，除去非腫瘤組織包括血污、脂肪、腫瘤新生血管、被膜等，電子天平稱取各組腫瘤組織，計算完整剝離后的瘤體平均重量，與模型組比較，計算腫瘤生長抑制率。腫瘤生長抑制率=（模型組平均瘤重-環磷酰胺組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%。

1.5.4 計算小鼠肝、脾指數及生存期延長率 小鼠腹水瘤模型各組接種腹水瘤細胞24 h后分別每日稱量體重、量取腹圍，按實驗要求給藥并繼續飼喂，直至小鼠死亡前1 d，計算小鼠體重增重數（g）和腹圍增長數（cm）。生存期延長率計算法：以接種腫瘤之日算起至模型組小鼠全部死亡結束實驗并記錄死亡時間。生存期延長率（%）=環磷酰胺組平均生存天數－模型組平均生存天數/對照組平均生存天數×100%；脾臟指數=小鼠脾臟重量（mg）/小鼠體重（g）；肝臟指數=肝臟重量（100 g）/小鼠體重（g）。

1.5.5 檢測基因表達 Western blot分析：具體步驟詳見《分子克隆》[7]，操作步驟如下：取預冷的玻璃組織研磨器加入所需瘤體組織和組織裂解液500μL[含苯甲基磺酰氟（PMSF）（2±1）μL]，充分研磨裂解半小時，轉入離心管中，反復振蕩，劇烈渦旋15 s，靜置10 min，4℃下12 000 r/min，離心20 min，收集上清至離心管中靜置10 min（全部冰上操作），離心取上清，進行蛋白質濃度測定（BCA法）。取蛋白40μg利用Tris甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），12%分離膠和6%濃縮膠，后電轉至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗[血管內皮細胞生長因子（VEGF）、P53、P21、凋亡抑制基因（Bcl-2）；1∶1 000]4℃過夜，緩沖液吐溫（tris buffered saline tween，TBST）洗膜后，加入HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜后，增強化學發光法（enhanced chemiluminescence，ECL）發光，采用Alpha Ease FC 4.0軟件進行光密度分析，結果以蛋白相應水平與β-actin比值表示。

1.6 統計學方法

應用SPSS 12.0軟件對數據進行統計處理。計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 荷瘤小鼠一般情況

模型組，7 d后生理變化明顯出現異常：精神不振、食欲差、畏寒扎堆、體毛稀疏且干澀、行動遲緩、個別出現肉瘤破潰、腹水形成，環磷酰胺組較模型組狀況好，但個別亦有少毛、脫毛、精神不振、懶于活動等情況，但無肉瘤破潰及腹水形成。

2.2 環磷酰胺對小鼠S180肉瘤的影響

荷瘤小鼠建模成功，模型組小鼠在接種后第5天即發現有出瘤現象，且發展較快，而環磷酰胺組出瘤時間延長到第10天，且腫瘤生長緩慢。在剝離小鼠瘤塊時，亦發現環磷酰胺組的小鼠瘤塊體積小，界限分明，質地較硬易剝離，而模型組小鼠的瘤塊明顯偏大，有的質地軟爛、界限模糊，甚至浸潤到胸骨和鎖骨，不易剝離，與模型組瘤重[（1.31±0.41）g]相比，環磷酰胺組瘤重[（0.15±0.12）g]顯著減小（P＜0.01），其抑瘤率達到88.55%，見圖1。

圖1 環磷酰胺對小鼠S180肉瘤的抑制情況

2.3 腹水瘤小鼠體重、腹圍、存活期及肝脾指數的變化

腹水瘤小鼠建模成功，環磷酰胺組小鼠存活天數均較模型組長，生命延長率為57.73%，并且環磷酰胺組腹水相對清亮、色淺，而模型組多為血性腹水，腹圍增長也較模型組小，但小鼠體重增加緩慢，且肝、脾指數均比模型組指數小，差異有統計學意義。見表1。

表1 環磷酰胺對小鼠體重、腹圍增長、存活期以及肝、脾臟指數的影響（±s）

表1 環磷酰胺對小鼠體重、腹圍增長、存活期以及肝、脾臟指數的影響（±s）

注：與對照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與模型組比較，③P＜0.05，④P＜0.01；“-”表示正常小鼠無需計算生命延長率

組別 體重增長（g）腹圍增長（cm）存活天數（d）生命延長率（%）肝臟指數 脾臟指數對照組模型組環磷酰胺組6.76±1.56 4.85±1.21①3.42±1.67②④0.58±0.09 3.17±0.33②2.30±0.66②④-9.7±2.7 15.3±1.1④-0 57.73 4.04±0.47 4.32±0.14 3.26±0.27①④3.45±0.58 3.84±0.56 2.45±0.34①④

2.4 腫瘤組織中各基因表達情況

利用荷瘤小鼠實體瘤子，采用Western blot方法檢測主要腫瘤相關信號分子VEGF、P53、P21、Bcl-2。實驗結果如表2顯示，環磷酰胺組P53蛋白的相對表達量明顯高于模型組（con）（P＜0.01）；而P21是該信號通路的經典下游分子，但其表達沒有明顯的變化；Bcl-2實驗結果顯示，環磷酰胺組可以明顯降低腫瘤細胞內Bcl-2分子的表達量，與模型組相比，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；與腫瘤血管生成密切相關的VEGF基因是大多數抗腫瘤藥物的首選靶位點，Western blot檢測結果顯示：與模型組相比，環磷酰胺組可以明顯降低腫瘤細胞內VEGF基因的表達水平（P＜0.01）。見圖2。

表2 四種蛋白含量表達水平變化

圖2 免疫印跡鑒定分析四種蛋白含量表達水平的變化

3 討論

環磷酰胺是一種常用的細胞毒抗癌化療藥物，為直接破壞DNA并阻止其復制的抗癌機制，對惡性淋巴瘤、急性或慢性淋巴細胞白血病、多發性骨髓瘤有較好的療效，對乳腺癌、睪丸腫瘤、卵巢癌等均具有一定的療效。其藥理作用及藥代動力學指標均有了較為明確的研究，成為目前抗腫瘤藥物實驗研究中廣泛應用的對照藥品。因此，為更好地發揮其在腫瘤動物實驗中作為陽性藥物的選擇性優勢，急待進一步研究環酰胺的抗腫瘤作用及其抑瘤機制。而當今抗腫瘤藥物主要通過激活或者抑制一系列的腫瘤相關信號通路而發揮治療腫瘤的作用。經典的腫瘤相關信號通路涉及腫瘤抑癌基因P53，P21信號通路；抗細胞凋亡基因Bcl-2信號通路；血管生長因子VEGF信號通路等。本研究對環磷酰胺的抑瘤作用分別對上述信號通路進行相關檢測。

P53是迄今發現與人類腫瘤相關性最高最經典的抑癌基因[8]，研究表明，在人類50%的腫瘤中都發現P53基因有缺失或突變[9]，經實驗研究發現，當環磷酰胺作用腫瘤細胞后，能促使P53蛋白明顯表達，同時，筆者進行了P53下游分子P21的檢測，與對照組相比，P21蛋白表達量卻沒有變化，由此推測環磷酰胺通過激活P53分子發揮其抑瘤作用，而不是通過P53→P21這條經典的信號通路實現的，這與文獻報道相一致[10]。

血管內皮細胞生長因子是目前活性最強、專屬性最高的血管生成因子，在腫瘤血管生成中處于核心地位[10]。血管生成過程中的關鍵因子是VEGF及其受體，它與腫瘤生長侵襲及轉移有著密切關聯，血管生成更易引起實體瘤的增生和轉移，幾乎所有的腫瘤都能產生VEGF，并且在腫瘤患者的血清及瘤體內均能檢測到異常增高的VEGF[11]。本實驗研究表明，環磷酰胺組明顯下調瘤體中VEGF蛋白表達水平，因此初步認為，抑制腫瘤的增生可能是環磷酰胺通過降低VEFG的活性而達到抑瘤效果的。根據功能的不同，Bcl-2基因家族可以分為兩大類：一類是Bcl-2為代表的抗細胞凋亡基因，另一類是bax促細胞凋亡基因。通常情況下，兩種蛋白表達量在細胞內處于相對穩態，而穩態一旦被打破，信號分子Bcl-2的活性更高，最終導致腫瘤細胞的無限增殖，Bcl-2的異常表達已經在一系列腫瘤組織的研究中得到證實[12]。筆者研究發現，與對照組相比，環磷酰胺Bcl-2蛋白表達量明顯降低，由此推測可能是通過下調Bcl-2蛋白表達水平而起到抑瘤的作用，具體機制有待進一步實驗研究、探討。

總之，本實驗結果表明，環磷酰胺對小鼠S180肉瘤的抑瘤作用穩定，可重復性強，其抑瘤率均可穩定達到70%以上，并可通過促進抑癌基因P53的表達，抑制VEGF的生成，降低抗凋亡基因Bcl-2的表達等多種途徑，發揮抑制腫瘤的作用，研究發現該腫瘤相關分子機制，將為環磷酰胺作為抗腫瘤陽性藥物動物模型奠定重要的理論基礎。

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