siRNA－survivin 與GRIM－19 共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對前列腺癌DU145 細(xì)胞生長的抑制作用*

沈維高， 趙麗晶， 蓋曉東， 蘆麗莉， 葛 賀， 陳立松， 劉艷波△， 趙雪儉△

(1北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，吉林 吉林132013;2吉林大學(xué)前列腺疾病防治研究中心，吉林 長春130021)

存活蛋白(survivin)屬于凋亡抑制蛋白，其表達(dá)強(qiáng)弱與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，可作為前列腺癌預(yù)后的分子標(biāo)志物［1－2］。利用RNA 干擾技術(shù)抑制細(xì)胞內(nèi)survivin 的過度表達(dá)可抑制腫瘤的生長，從而起到抗腫瘤作用［3］。GRIMs(genes associated with retinoid－interferon－induced mortality)屬于維甲酸(retinoic acid，RA)－ 干擾素(interferon，IFN)誘導(dǎo) 死亡 的相 關(guān) 基 因 家 族［4］。GRIM－19 是GRIMs 家族重要成員，在正常細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，而在癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)降低或缺失，而其高表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡［5－6］。RNA干擾并不能100%抑制目的基因的表達(dá)，于是我們嘗試沉默survivin 同時(shí)高表達(dá)GRIM－19，而有關(guān)其對腫瘤的生長抑制作用國內(nèi)外未見報(bào)導(dǎo)。本研究擬構(gòu)建siRNA－survivin 和GRIM－19 共表達(dá)質(zhì)粒，在降低細(xì)胞癌基因同時(shí)增強(qiáng)死亡調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，從而增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)，為前列腺癌的基因治療提供新的策略。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

人前列腺癌DU145 細(xì)胞株由吉林大學(xué)前列腺防治研究中心饋贈(zèng)。細(xì)胞用含有10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液37 ℃、5% CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，以0.25%的胰酶消化傳代。

2 主要試劑

T4 DNA 連接酶購自Promega;Bgl Ⅱ、Nru Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和DNA 凝膠回收試劑盒購自大連寶生物工程公司;DNA purification system 為Promega產(chǎn)品;DNA DL2000 marker 和DL15000 marker 均為TaKaRa 產(chǎn)品。引物合成及測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。溴化乙啶、瓊脂糖、MTT 和DMSO 購自Sigma;DEPC 購自Merk;高保真Taq DNA聚合酶、dNTP、MMV 逆轉(zhuǎn)錄酶及質(zhì)粒提取和純化試劑盒購自Promega;RNA 酶及蛋白酶K 購于Ambion;Lipofectamine 2000 及Trizol 為Invitrogen 產(chǎn)品;胰酶、DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清為Hyclone 產(chǎn)品;其它常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

3 主要方法

3.1 真核表達(dá)質(zhì)粒siRNA－survivin 和GRIM－19的構(gòu)建 在本課題組前期工作的基礎(chǔ)上，擴(kuò)增已構(gòu)建成功的pGCsilencer－U6－siRNA－survivin 質(zhì)粒(簡稱pGCsi－sur)的U6 啟動(dòng)子及siRNA－survivin［7］，在其上、下游分別引入BglⅡ和NruⅠ雙酶切位點(diǎn)，與線性化的TA 載體連接，然后進(jìn)行擴(kuò)增，其上游引物為5'－GC (AGATCT)TGCTTCGCGATGTACGGGCC－ 3';下游引物為5'－CG(TCGCGA)GGGCTATGAACTAATGACCC－3';PCR 擴(kuò)增條件:94℃5 min，94 ℃30 s，55 ℃45 s，72 ℃45 s，72 ℃45 s，35 個(gè)循環(huán);擴(kuò)增片段長度為585 bp。PCR 產(chǎn)物電泳、回收、連接后測序。用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和NruⅠ雙酶切pcDNA3.1－GRIM－19 質(zhì)粒(由美國胡嘉娣老師饋贈(zèng))，使其線性化，回收，將U6－siRNA－survivin 與線性化的pcDNA3.1－GRIM－19(簡稱pGRIM－19)連接，插入pcDNA3.1－GRIM－19 多克隆酶切位點(diǎn)內(nèi)，共表達(dá)基因質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pcDNA3.1－GRIM－19/siRNA－survivin (簡 稱pGRIM－19－si－survivin)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，挑取單克隆后擴(kuò)增，提取質(zhì)粒并測序鑒定。共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖1 所示。

3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 將重組質(zhì)粒psi－scramble、psi－survivin、pGRIM－19 和pGRIM－19－si－survivin 分別轉(zhuǎn)染人前列腺癌細(xì)胞DU145 中，48 h 后提取RNA，檢測survivin 和GRIM－19 mRNA 表達(dá)水平。

Figure 1. The construction process of pGRIM－19－si－survivin co－expression plasmid圖1 表達(dá)質(zhì)粒pGRIM－19－si－survivin 的構(gòu)建

3.3 Survivin 和GRIM－19 mRNA 表達(dá)的檢測 應(yīng)用Trizol 試劑提取轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，應(yīng)用人β－actin 引物進(jìn)行擴(kuò)增，鑒定模板質(zhì)量。β－actin 的引物序列為:sense:5'－CTGGGACGACATGGAAAA－3'，antisense:5'－AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC－3'，擴(kuò)增片段長度為600 bp;survivin 引物序列:sense:5'－GAATTCATGGGTGCCCCGACGTTGCC－3'，antisense:5'－AGATCTTTCTTCTTATTGTTGGTTTCC－3'，擴(kuò)增片段長度為415 bp;GRIM－19 引物序列:sense:5'－CTGGGACGACATGGAGA-AA－3'，antisense:5'－AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC－3'，擴(kuò)增片段長度為485 bp。所有引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后拍照，并進(jìn)行定量分析。

3.4 細(xì)胞增殖活性檢測 將實(shí)驗(yàn)分為5 組，即mock、psi－scramble、psi－survivin、pGRIM－19 和pGRIM－19－si－survivin，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在培養(yǎng)細(xì)胞44 h 和68 h 后，各孔加入濃度為5 g/L MTT，常規(guī)方法檢測各孔的吸光度(absorbance，A)，按公式:抑制率(%)= (對照組A 值－實(shí)驗(yàn)組A 值)/對照組A 值×100%，計(jì)算各組抑制率。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(± s)表示，組間比較采用One－way ANOVA，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 pGRIM－19－si－survivin 共表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

根據(jù)前期的研究結(jié)果，以pGCsi－sur 為模板擴(kuò)增U6－siRNA－survivin 片段，見圖2，然后與TA 載體連接，用BglⅡ和NruⅠ雙酶切，獲得約585 bp 長度的片段，見圖3，測序結(jié)果與設(shè)計(jì)完全吻合，U6－siRNA－survivin 測序結(jié)果見圖4。

用BglⅡ和NruⅠ雙酶切pGRIM 和pGRIM－19－si－survivin，其電泳圖見圖5、6，證明共表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Figure 2. Electrophoretic identification of specific U6－siRNAsurvivin PCR product. M:DL2000 DNA marker.圖2 U6－siRNA－survivin PCR 產(chǎn)物的電泳鑒定結(jié)果

Figure 3. Electrophoretic identification of pMD18－U6－survivin plasmid digested with BglⅡand NruⅠ. M:DL15000 DNA marker;Lane 1，3:pMD18－U6－survivin recombinant plasmid;Lane 2，4:pMD18－U6－survivin recombinant plasmid digested with BglⅡand NruⅠ;M2:DL2000 DNA marker.圖3 pMD18－U6－survivin 質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果

2 共表達(dá)質(zhì)粒對DU145 細(xì)胞survivin 和GRIM－19 mRNA 表達(dá)影響

與mock 組比較，psi－scramble、psi－survivin、pGRIM－19 組及pGRIM－19－si－survivin 組survivin mRNA 表達(dá)水平分別為1.02 ± 0.09、0.55 ±0.05、0.62 ± 0.08 和0.35 ± 0.05，mock 與psi－scramble 無顯著差別(P ＞0.05)，而psi－survivin 和pGRIM－19 組survivin 的表達(dá)水平降低，共表達(dá)組降低更明顯(P ＜0.05，P ＜0.01)。psi－survivin、pGRIM－19 和pGRIM－19－si－survivin 組GRIM－19 表達(dá)增強(qiáng)，分別為mock 組的1.93 ±0.14、2.57 ±0.20 和4.12 ±0.21(P ＜0.01)，而psi－scramble 的表達(dá)水平為0.94 ±0.14，未有明顯變化(P ＞0.05);與pGRIM－19 組比較，pGRIM－19－si－survivin 增強(qiáng)pGRIM－19 表達(dá)的作用更明顯(P ＜0.05)，顯示出協(xié)同作用，見圖7。

Figure 4. The nucleotide base sequence of U6－siRNA－survivin.圖4 U6－siRNA－survivin 的測序結(jié)果

3 共表達(dá)質(zhì)粒對DU145 細(xì)胞增殖抑制作用

DU145 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后培養(yǎng)48 h 及72 h，應(yīng)用MTT 比色法觀察各組細(xì)胞的增殖能力，以mock 組的生存率為100%，轉(zhuǎn)染48 h 后，psi－scramble 組的生存率為94.0% ± 7.3%，兩者之間無差異(P ＞0.05);而psi－survivin、pGRIM－19 和pGRIM－19－si－survivin 3 組細(xì)胞生存率分別為58.0% ±7.2%、62.1% ±6.1%和50.2% ±4.8%，與mock 組比較差異顯著(P ＜0.05)，pGRIM－19－si－survivin 組與psi－survivin 和pGRIM－19 組比較差異不明顯(P ＞0.05);轉(zhuǎn)染72 h 后psi－scramble 組的增殖率為90.1% ±5.5%，psi－survivin、pGRIM－19 和pGRIM－19－si－survivin 3 組分別為43.4% ± 4.3%、51.3% ±6.7%和26.8% ±7.1%，與兩陰性對照組相比，差異明顯(P ＜0.05，P ＜0.01);與psi－survivin 和pGRIM－19 組比較，pGRIM－19－si－survivin 抑制作用明顯增強(qiáng)(P ＜0.05)，顯示出協(xié)同抑制效應(yīng)，見圖8。

Figure 5. Electrophoretic identification of pGRIM－19 plasmid digested with BglⅡand NruⅠ. M1:DL15000 DNA marker;Lane 1:pGRIM－19 recombinant plasmid;Lane 2:pGRIM－19 recombinant plasmid digested with BglⅡand NruⅠ;M2:DL2000 DNA marker.圖5 pGRIM－19 雙酶切鑒定結(jié)果

Figure 6. Electrophoretic identification of pGRIM－19－si－survivin recombinant plasmid digested with BglⅡand NruⅠ.M1:DL15000 DNA marker;Lane 1:pGRIM－19－si－survivin recombinant plasmid;Lane 2:pGRIM－19－si－survivin recombinant plasmid digested with BglⅡand NruⅠ;M2:DL2000 DNA marker.圖6 pGRIM－19－si－survivin 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

討 論

凋亡抑制蛋白survivin 可特異性表達(dá)在人和鼠的胚胎發(fā)育組織，也可表達(dá)于人類多種腫瘤組織，在成人的正常組織中幾乎不表達(dá)［8］。我們前期研究表明survivin 在前列腺癌組織高表達(dá)，其異常激活導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少，進(jìn)而參與了前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展［9］。而且，針對survivin 的小干擾RNA，體內(nèi)外均可下調(diào)前列腺癌survivin 基因表達(dá)并具有抑瘤效應(yīng)［10］。但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，RNAi 并不能完全阻斷基因表達(dá)，尤其是異常高表達(dá)的基因。RNAi 只能降解與其序列同源的mRNA，對已經(jīng)表達(dá)的蛋白，應(yīng)用RNAi 方式是無法清除的。為了提高抗腫瘤作用，我們選擇聯(lián)合基因治療手段，即沉默survivin 同時(shí)增加另一種抗腫瘤基因(GRIM－19)的表達(dá)。

Figure 7. RT－PCR analysis of survivin and GRIM－19 mRNA expression in DU145 cells transfected with recombinant plasmids. ±s. n =3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs mock or psi－scramble;#P ＜0.05 vs psi－survivin or pGRIM－19.圖7 pGRIM－19－si－survivin 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DU145 細(xì)胞后survivin 和GRIM－19 基因表達(dá)情況

Figure 8. Growth inhibition of DU145 cells transfected with different plasmids. ± s. n = 3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs mock or psi－scramble;#P ＜0.05 vs psi－survivin or pGRIM－19.圖8 pGRIM－19－si－survivin 重組 質(zhì)粒對前列腺癌DU145 細(xì)胞增殖抑制作用

GRIM－19 是由IFN－β 聯(lián)合RA 誘導(dǎo)表達(dá)的死亡調(diào)節(jié)因子，在大多數(shù)正常組織中高表達(dá)，但在多數(shù)腫瘤組織表達(dá)降低或缺失。劉艷波等［10］研究發(fā)現(xiàn):前列腺癌組織及前列腺癌細(xì)胞GRIM－19 表達(dá)為陰性，這種差異性使得GRIM－19 作為靶基因進(jìn)行治療成為可能。GRIM－19 高表達(dá)后可明顯抑制STAT3 的表達(dá)，而抑制STAT3 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可影響其對survivin 的表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖過程［11］。根據(jù)前期工作，在增強(qiáng)GRIM－19 表達(dá)的同時(shí)抑制survivin 表達(dá)，有望成為腫瘤基因治療的新策略。本研究應(yīng)用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了真核共表達(dá)質(zhì)粒pGRIM－19－si－survivin，應(yīng)用RT－PCR 技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn):該質(zhì)粒在下調(diào)survivin 表達(dá)同時(shí)增強(qiáng)了GRIM－19 的表達(dá)。應(yīng)用MTT 法檢測了其對細(xì)胞增殖作用的影響，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒可協(xié)同性地抑制前列腺癌DU145 細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系。上述結(jié)果為研究該質(zhì)粒的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為前列腺癌的基因治療指明了方向。

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