生長激素釋放肽在非小細胞肺癌組織的表達及其意義

張曉飛 魏亞強

1.陜西省延安市人民醫院腫瘤科，陜西延安 716000；2.陜西省延安市人民醫院呼吸內科，陜西延安 716000

1999年，Kojima等[1]發現生長激素釋放肽（Ghrelin）是促生長激素分泌物受體（GHS-R）的第一個內源性配體，由28個氨基酸殘基構成的一種小分子多肽。Ghrelin主要的產生部位是胃黏膜，但是在多種組織中也有表達，如腸道、胰腺、下丘腦、垂體、腎、胎盤等[2-4]，Ghrelin作為一種腦腸肽表現出了不同的生理調節功能。本次研究選擇2007年9月～2009年12月我院收治的非小細胞肺癌（NSCLC）患者標本72例，所有患者均施行根治性手術治療，通過觀察Ghrelin在NSCLC組織中的表達，探討其臨床意義，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為2007年9月～2009年12月在我院施行根治性手術治療的NSCLC患者72例，設置肺正常組織作為對照，選擇同期手術正常標本30例，經過病理HE染色確診全部病例符合研究標準。72例患者中，男41例，女31例；年齡36～75歲，平均（64.5±2.5）歲；所有患者均未在術前接受任何的化療放療?；颊咴邝[癌、腺癌、高分化癌、中分化癌和低分化癌分別有42、30、28、22、22例。TNM分期（2009年肺癌國際分期修訂版）中，Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期27例，發生與未發生淋巴結轉移的各為32例和40例。

1.2 方法

1.2.1 試劑 純化兔抗人Ghrelin抗體（一抗）（北京博奧森生物技術有限公司生產）。二抗和三抗的S-P試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司生產），包括內源性過氧化物酶阻斷劑（3%雙氧水），正常山羊血清工作液，二抗（生物素標記的山羊抗兔IgG）工作液，三抗（辣根酶標記的鏈霉卵白素）工作液，DAB（3，3-二氨基聯苯胺）試劑盒。

1.2.2 標本處理及組織切片 所有組織標本都采用10%中性甲醛溶液進行固定，常規進行脫水，石蠟包埋處理，切片厚度5μm，膠片撈片均涂有氨丙基-三乙氧基硅烷。

1.2.3 免疫組織化學法檢測 免疫組化SP法，在60℃烤箱中放置染色石蠟切片，烤40 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化。用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，然后滴加3%雙氧水封閉，室溫下進行10 min，以去除內源性過氧化物酶。用PBS沖洗5 min，沖洗3次；然后山羊血清封閉，室溫下進行15 min；然后，滴加50μL一抗溶液，在4℃溫度下過夜。第2天，采用PBS沖洗5 min，沖洗3次，然后滴加二抗溶液，在37℃的溫度孵育30 min；然后用PBS沖洗5 min，沖洗3次，然后滴加三抗溶液，在37℃的溫度下孵育30 min；3，3-二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染、脫水、透明、封片。光鏡觀察，空白陰性對照組每次染色的時候都以0.01 mmol/L PBS代替一抗溶液。

1.3 結果判斷標準

應用雙人雙盲法進行全面的觀察與判斷，主要判斷標準有：①陽性細胞：腫瘤細胞的胞漿內有棕黃色顆粒并且染色強度顯著高于非特異性背景著染。②顯微鏡下每例隨機選擇10個高倍視野（×400），然后計算出陽性細胞的百分比。根據陽性細胞的百分比分為2級：陰性：無陽性細胞或≤10%，陽性：＞10%。

1.4 統計學方法

本次研究所得數據均采用SPSS 17.0統計軟件給予處理，計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ghrelin在肺正常組織與肺癌組織中的表達

肺正常組織與肺癌組織的Ghrelin的表達中，陽性率分別為13.33%和58.33%，前者明顯低于后者，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。Ghrelin陽性信號位于肺癌細胞漿內，呈棕黃色顆粒。肺癌組織中Ghrelin的表達見圖1。

表1 肺癌組織與肺正常組織中Ghrelin的表達（例）

圖1 不同肺癌組織中Ghrelin的表達情況（免疫組化SP法）

2.2 Ghrelin在肺癌組織的表達及臨床意義

Ghrelin在肺癌組織中表達與臨床病理參數之間不存在統計學差異的包括性別、吸煙與否、分化程度、病理分型，即P＞0.05；Ghrelin在肺癌組織中表達與臨床病理參數之間存在統計學差異的為臨床分期和淋巴結轉移與否，即P＜0.05。見表2。

表2 肺癌組織中Ghrelin的表達與臨床病理參數的關系（例）

3 討論

Ghrelin是迄今發現的唯一一種GHS-R的內源性配體，Kojima等[1]于1999年就已經開展研究并通過采用免疫組化的方法從小鼠和人的胃內分泌細胞及下丘腦弓狀核中將Ghrelin分離出來，名稱的來源是因為具有促進生長激素釋放的作用。Ghrelin是一種由28個氨基酸組成的3位絲氨酸?；男》肿佣嚯?，Ghrelin主要的產生部位是胃黏膜，但是在多種組織中也有表達，比如腸道、胰腺、下丘腦、垂體、腎、胎盤等[2-4]；Ghrelin的受體在很多組織中都有分布具不同亞型，比如腦、心臟、肺、胰腺、腸、脂肪組織及腎臟等[5]，Ghrelin具有廣泛的生物學效應與其具有廣泛的受體分布有緊密聯系。研究表明，Ghrelin異常高表達具有促使細胞過度增殖及其惡性轉化的作用，另外研究還證明，Ghrelin與部分腫瘤在病發和惡化發展過程中有著緊密的關系，但是在肺癌中Ghrelin與其相互之間的作用關系當前還無法明確。

Ghrelin在腫瘤的發生過程中可能具有一定的意義，因為大量的研究研究表明，Ghrelin在中樞神經系統的垂體瘤[6]、乳腺癌組織和細胞株[7]、胃神經內分泌細胞增生和腸癌[6]、甲狀腺濾泡狀癌、甲狀腺癌細胞株[8]等多種上皮細胞起源的腫瘤組織及其癌細胞株中存在表現情況，也有相關報道顯示，Ghrelin在部分的固醇類組織也能表達，包括睪丸、前列腺等[9]。發現Ghrelin和GHS-Rla的mRNA和蛋白兩者同時都在前列腺癌細胞株（ALVA41、DU145、LNCaP和PC-3）中表達[10]。研究表明Ghrelin起到了一種促癌基因的作用，能夠促進腫瘤的發生及其發展。但是另外的一些研究卻認為，Ghrelin可能起到了一種抑癌基因的作用，抑制了乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌細胞株的增殖，因為在臨床中不同類型的組織、細胞以及采用差異化的實驗方法都能引致兩者的結果出現不一致的情況。

據研究報道[11]顯示，Ghrelin GHS-1a mRNA的表達情況在不同的分泌性，包括內分泌和非內分泌性的肺癌組織中均可能實現。Karapanagiotou等[12]臨床實踐中通過對101例不能接受相關手術的NSCLC患者進行檢測，并選擇正常健康人的血清60例作為對照，檢測Ghrelin的結果表明，Ghrelin水平在肺癌病患中明顯高于健康者（P＜0.05），提示肺癌的形成可能與患者的Ghrelin水平增高具有相關性。本次研究結果表明，Ghrelin表達在陽性率上肺癌組織的表達情況明顯要比肺正常組織者要高，差異有統計學意義（P＜0.05），結果顯示，Ghrelin表達增高、活性增強從而使得急速了細胞周期、促進細胞在增殖上的速率，參與到肺癌的形成病發及發展等過程中；此外，有學者研究認為肺癌發病的主要因素之一就是因為出現細胞凋亡障礙問題，而該問題的產生與Ghrelin被激活、與細胞凋亡有關的抑癌基因p73等下游基因發生突變有直接的關系。本次研究結果還表明，生長激素釋放肽在肺癌組織中表達與臨床病理參數之間不存在統計學差異的包括性別、吸煙與否、分化程度、病理分型，即P＞0.05，生長激素釋放肽在肺癌組織中表達與臨床病理參數之間存在統計學差異的為臨床分期和淋巴結轉移與否，即P＜0.05。臨床分期越晚，表達越高；肺癌組織中，出現淋巴結轉移的Ghrelin表達明顯比無轉移的高，提示肺癌組織中的淋巴轉移與Ghrelin有相關性。

綜上所述，Ghrelin表達與肺癌的形成與發展存在密切的關系，對于肺癌早期診斷有積極的意義，并作為一個重要的指標應用于肺癌的診斷中，在研究結果中顯示，患者受到肺癌的侵襲后，發生轉移的過程與Ghrelin的表達也存在明顯的關系，表明腫瘤具有比較高的浸潤性及其不良預后。

[1]Kojima M，Hosoda H，Data Y，et al.Ghrelin is hormone releasing acylated peptide from stomach[J].Nature，1999，402（6762）：656-660.

[2]Gualillo O，Caminos JE，Blamco M，et al.Ghrelin，a novel placental derived hormone[J].Endocrinology，2001，142（2）：788-794.

[3]Peino R，Baldell IR，Rodrigue-Garcia J，et al.Ghrelin induced growth hormone secretion in humans[J].Eur J Clin Endocrinol，2000，143（6）：11-14.

[4]Mori K，Yoshimoto A，Takaya K，et al.Kidney produces a novel acylated peptide ghrelin[J].FEBS Lett，2000，486（3）：213-216.

[5]Papatt IM，Ghe C，Casson IP，et al.Growth hormone secretagogue binding sites in peripheral human tissues[J].Clin Endocrinol Metab，2000，85（10）：3803-3807.

[6]Korbonits M，Bustin SA，Kojim M，et al.The expression of the growth hormone secretagogue receptor ligand in normaland abnormal human pituitary and other neuroendocrine tumors[J].J Clin Endocrinol Metab，2001，86（2）：881-887.

[7]Cassoni P，Papotti M，Ghe C，et al.Identification，characterization and biological activity of specific receptors for natural（ghrelin）and synthetic growth hormone secretagogues and analogs in human breast carcinomas and cell lines[J].J Clin Endocrinol Metab，2001，86（4）：1738-1745.

[8]Kanamoto N，Akamim T，Hosoda H，et al.Substantial production of ghrelin by a human medulley thyroid carcinonm cell line[J].J Clin Endocrinol Metab，2001，86（10）：4984-4990.

[9]Tena SM，Barreiro ML，Gonzalez LC.Novel expression and functional role of ghrelin in rat testis[J].Endocrinology，2002，143（2）：717-725.

[10]Jefery PL，Herinston AC，Chopin IX.Expression and action of the growth hormone releasing peptide ghrelin and its receptor in prostate cancer cell lines[J].J Endocrinol，2002，172（3）：7-11.

[11]Dixit VD，Schafer EM，Pyle RS，et al.Ghrelin inhibits leptin and activation induced proinflammatory cytokine expression by human monocytes and T cells[J].J Clin Invest，2004，l14（1）：57-66.

[12]Karapanagiotou EM，Polyzos A，Dilana KD，et al.Increased serum levels of ghrelin at diagnosis mediate body weight loss in non-small cell lung cancer（NSCLC）patients[J].Lung Cance，2009，66（3）：393-398.