TCAB1慢病毒表達載體的構建及其在人子宮內膜間質細胞中的表達

顧 林 史穎莉? 倪 婕 陳 捷 李 瑛

1.南京醫科大學附屬南京婦幼保健院，江蘇南京 210004；2.江蘇省計劃生育研究所，江蘇南京 210029

TCAB1是人腫瘤細胞中近期發現的端粒酶蛋白組分，其表達缺失可使端粒酶復合物無法運送至染色體末端的端粒合成目的地，雖不影響端粒酶逆轉錄酶（hTERT）對自身攜帶RNA組分（hTR）的催化，但最終仍導致端粒形成受限。由于：①端粒機制與惡性腫瘤等細胞的增殖、遷移、侵襲屬性密切相關[1-2]；②內異癥雖為良性疾病，其遠處種植和生長特性卻與惡性腫瘤類似[3]。筆者前期研究中通過基因芯片實驗發現，TCAB1異常表達于內異癥異位內膜組織，提示TCAB1可能通過端粒機制參與了內異癥異位內膜的生長、侵襲等病理機制，并介導了在內異癥形成中的作用。為進一步研究TCAB1功能及作用機制，筆者擬構建TCAB1的慢病毒表達載體。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

總RNA抽提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR Taq酶購自TaKaRa公司；限制 性內切酶（EcoRI和NotI）購自NEB公司；感受態細胞TOP10實驗室自備；Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0、TA克隆試劑盒購自TaKaRa；逆轉錄試劑盒（SuperScriptRⅢFirst-Strand Synthesis System）購自invitrogen公司；測序委托上海英俊生物公司進行；慢病毒過表達載體（pLVX-IRES-ZsGreen）購自Clonetech公司；子宮內膜間質細胞株（St-T1b）購自ATCC。

1.2 TCAB1（WRAP53）全長基因TA克隆

1.2.1 引物設計 根據Genebank中報道的基因序列，應用軟件設計TCAB1全長基因擴增引物（Invitrogen公司）：primer-F：CGGAATTCCGGCCATGAAGA CTTTGGAGACTCAAC；primer-R：ATTTGCGGCCGCACC TTATATCAGCTCA CC ACACCT；上下游引物分別含有EcoRI和NotI酶切位點；PCR終產物大小為1 675 bp。

1.2.2 RT-PCR TRIzol法抽提人子宮內膜間質細胞總RNA，Nanodrop檢測RNA濃度，1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，如見清晰的18 S和28 S兩條帶，說明總RNA完整性較好。取1μg總RNA進行逆轉錄反應，PCR循環參數為：5℃冷卻10 mim、50℃孵育50 min、85℃5 min終止反應。

1.2.3 目的基因片段擴增PCR 以巢式PCR技術將目的基因片段擴增，第一次PCR循環參數：95℃預變性5 min、94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸90 s、72℃延伸10 min，共25個循環；第二次PCR循環參數同第一次PCR，共30個循環。凝膠掃描成像系統記錄電泳結果。

1.2.4 PCR產物TA克隆 將PCR產物使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0回收，進行TA克隆，轉化感受態細胞TOP10,使用含100 mg/mL氨芐抗生素的LB瓊脂平板篩選轉化子。挑取單個菌落，在含100 mg/mL氨芐抗生素的LB培養液中擴大培養，提取質粒并分別用EcoRI-HF和NotI-HF進行酶切鑒定，酶切成功送英俊公司測序。

1.3 TCAB1（WRAP53）慢病毒表達載體構建

將真核表達載體pLVX-IRES-ZsGreen1與測序成功的TCAB1-TA克隆用EcoRI和NotI雙酶切，膠回收線性化載體和PCR目的產物，用T4DNA連接酶連接線性化載體和PCR純化產物16°C過夜，轉化感受態細胞top10，含100 mg/mL氨芐抗生素的LB瓊脂平板篩選轉化子。挑取單個菌落，在含100 mg/mL氨芐抗生素的LB培養液中擴大培養，提取質粒并分別用EcoRI和NotI進行酶切鑒定。

1.4 慢病毒包被

將HEK293T細胞（病毒包被細胞）均勻接種于培養皿中，待細胞融合度至70%左右時，轉染慢病毒表達質粒與包被質粒，轉染試劑與質粒比例（μg）為2.5∶1.0，慢病毒表達質粒與Pcgvp、Rev、Vsvg比例為1.5∶1.5∶1.0∶0.5，轉染48、72 h后收取病毒上清，2 000 g離心10 min棄細胞碎片，上清經0.45μm濾器過濾后分裝，-80℃凍存備用。

1.5 慢病毒感染子宮內膜間質細胞

傳代培養人子宮內膜間質細胞株（St-T1b），將其接種于6孔板中（105/mL），待細胞融合度達60%左右時，加入病毒上清，同時加入終濃度5μg/mL的poly brene，培養72 h在熒光顯微鏡觀察熒光表達情況以判斷感染效率。

1.6 實時定量PCR檢測過表達效果

收集感染過表達慢病毒的人子宮內膜間質細胞株，以空載慢病毒做對照。按照TRIzol試劑說明書提取細胞中總RNA，并進行逆轉錄反應，獲得cDNA產物。以此cDNA為模板，在ABI 7500型實時定量PCR儀上進行實時定量PCR反應。引物序列為Sense:5′-cagccagacacctcctacg-3′，Anti-sense:5′-tgaatgcgtcccagatat-3′，Roche LNA probe:#66（CAGCAGCC）；18s sense:5′-gcaattattccccatgaacg-3′，Anti-sense:5′-gggacttaatcaacgcaagc-3′，Roche LNA probe:#48（TTCCCAGT）。實時定量PCR反應體系為：Master Mix 10μL，cDNA 1μL，引物探針共1μL，雙蒸水8μL，共20μL。擴增條件：預變性95℃2min后，95℃10s，60℃30s，70℃45s，重復40個循環。用△△CT法計算TCAB1的相對表達量。

2 結果

2.1 基因擴增結果

以基因組為模板進行PCR擴增，得到大小為1 675 bp的片段（圖1），DNA測序證明擴增片段的核苷酸序列與Genbank中的TCAB1序列完全一致。

圖1 目的基因TCAB1的PCR產物凝膠電泳分析

2.2 TA克隆鑒定

結果顯示提取的質粒用限制性內切酶酶切后得到了與設定長度一致的TCAB1 cDNA片段，酶切成功送英俊公司測序，雙向測通，經比對后，與Genbank比對后，無堿基突變。

2.3 TCAB1（WRAP53）慢病毒表達載體鑒定

構建慢病毒表達質粒，提取質粒并分別用EcoRI和NotI進行酶切鑒定，結果顯示構建成功（圖2）。

圖2 慢病毒載體構建與酶切鑒定

2.4 檢測TCAB1基因在St-T1b細胞中的過表達效果

熒光顯微鏡下觀察：TCAB1基因重組慢病毒感染靶細胞后，可見較大比例的St-T1b表達綠色熒光（圖3A），提示TCAB1慢病毒感染成功；實時定量PCR法檢測結果提示：TCAB1基因重組慢病毒感染的細胞中TCAB1顯著過表達（圖3B）。證明TCAB1基因經重組慢病毒載體感染至St-T1b細胞后，能夠在靶細胞中穩定持續表達。

3 討論

TCAB1是端粒酶的新蛋白組分，它主要位于細胞核卡哈爾體內，控制端粒酶信號轉導。進行生物信息學分析后發現，該基因（NM_001143990.1）mRNA全長1 837 bp，開放閱讀框1 647 bp，編碼548個氨基酸，預測分子量59.3 kDa；NCBI在線Blast Genome分析提示，TCAB1基因定位于染色體17p13.1；運用TMHMM2.0、SignaliP和WoLF PSORT等生物信息學工具分析其蛋白屬性發現，其編碼蛋白無跨膜區，可能位于胞漿內。TCAB1位于細胞核卡哈爾體內，控制端粒酶信號轉導，與端粒形成密切相關[4]。已知TCAB1在多種腫瘤細胞中異常表達，能夠促進細胞轉移[5]。內異癥具有類似惡性腫瘤的遠處種植和生長特性，文獻已證實內異癥在位內膜組織中端粒酶活性與端粒長度高于正常內膜[6]，但未見涉及TCAB1、端粒酶、端粒在內異癥形成中功能研究的相關報道。由于TCAB1功能尚不是很清楚，因此構建該基因的過表達載體十分必要。

實現基因的過表達（gain of function）是基因功能研究的重要策略，其中慢病毒載體是基因表達的重要工具。慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒為基礎發展起來的基因治療載體，該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久表達。同時由于對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，對于干細胞和原代細胞研究具有重要意義。慢病毒的感染效率高、激發免疫反應的作用弱，而且目前沒有證據表明其對宿主細胞有毒性作用或影響宿主細胞的活力。慢病毒表達載體感染后所獲得的穩轉細胞基因表達穩定、持續時間長，避免了瞬時轉染每次試驗均需重復操作的試驗過程，而且也避免了瞬時轉染時所需轉染試劑對實驗的影響。因此本實驗選擇慢病毒載體研究基因的工具。本實驗選擇的慢病毒表達載體是pLVX-IRES-ZsGreen1，ZsGreen1熒光蛋白可以作為包被及病毒感染時候的marker，可以方便的觀察轉染和病毒感染效率，也可以在后續研究中通過熒光篩選穩定表達株。本實驗成功構建人TCAB1基因特異性的重組慢病毒過表達載體,且證實包被的慢病毒可實現TCAB1基因在人子宮內膜間質細胞株的過表達，為后續人TCAB1在人子宮內膜間質細胞的功能研究奠定了良好的實驗基礎。

[1]Goldblatt EM，Gentry ER，Fox MJ，et al.The telomerase template antagonist GRN163L alters MDA-MB-231 breast cancer cell morphology，inhibits growth，and augments the effects of paclitaxel[J].Mol Cancer Ther，2009，8（7）：2027-2035.

[2]Huang W，Rha GB，Chen L，et al.Inhibition of telomerase activity alters tight junction protein expression and induces transtendo helial migration of HIV-1 infected cells[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，298（4）：1136-1145.

[3]Taylor RN，Yu J，Torres PB，et al.Mechanistic and therapeutic implications of angiogenesis in endometriosis[J].Reprod Sci，2009，16（2）：140-146.

[4]Mahmoudi S，Henriksson S，WeibrechtⅠ，et al.WRAP53 is essential for Cajal body formation and for targeting the survival of motor neuron complex to Cajal bodies[J].PLoS Biol，2010，8（11）：e1000521.

[5]Mahmoudi S，Henriksson S，Farnebo L，et al.WRAP53 promotes cancer cell survival and is a potential target for cancer therapy[J].Cell Death Dis，2011，2：114.

[6]Hapangama DK，Turner MA，Drury JA，et al.Endometriosis is associated with aberrant endometrial expression of telomerase and increased telomere length[J].Hum Reprod，2008，23（7）：1511-1519.