大孔吸附樹脂純化延胡索總生物堿工藝研究

呂子明 劉文娟 于向紅 楊志云 梁俊清 屠鵬飛

1.北京大學(xué)藥學(xué)院 天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191；2.北京以嶺藥業(yè)有限公司，北京 100027

延胡索為罌粟科植物Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥塊莖，具有活血化瘀、理氣止痛之功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，延胡索具有抗?jié)儭⒁种莆杆岱置凇⒔獐d及增加冠狀動脈血流量、抗心律失常等作用[2]。延胡索生物堿包括叔胺堿和季胺堿，是其主要活性成分。目前，大孔樹脂在中草藥有效成分的分離、富集中的應(yīng)用越來越受到人們的重視[3]。本文旨在優(yōu)選出一種適合純化延胡索總生物堿的大孔樹脂，并對優(yōu)選出的大孔樹脂純化延胡索總生物堿時的工藝條件及參數(shù)進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

UV-2550紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Sartorius BS 110電子天平（德國賽多利斯公司）；延胡索藥材（購于河北省安國以嶺飲片有限公司，經(jīng)鑒定，符合《中國藥典》2010年版一部標(biāo)準(zhǔn)，批號：070902）；延胡索乙素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：0726-200208）；大孔吸附樹脂NKA-9（南開大 學(xué)）；HPD600、HPD500、HPD-450、HPD-400A、HPD-400、HPD100A（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；AB-8、D101、DM-130、D-100、D141（中藍(lán)晨光化工研究院物資公司）。95%乙醇（藥用規(guī)格，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為純化水，其他試劑均為分析純（北京化工廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 上柱藥液的制備

取延胡索藥材2 kg，用8倍量體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇提取3次，每次1.5 h。合并提取液，減壓濃縮至無醇味。加水定容至9 000 mL，抽濾，備用。

2.2 含量測定

2.2.1 總生物堿的含量測定

2.2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取延胡索乙素對照品適量，加甲醇制成1 mL含204.8μg的溶液，即得。

2.2.1.2 線性關(guān)系考察 精密吸取延胡索乙素對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，在280 nm處測定。以標(biāo)準(zhǔn)品延胡索乙素的濃度（X1）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y1=0.001 5X1-0.000 4，r=0.999 9。延胡索乙素在8.192 0～40.960 0μg/mL之間具有良好的線性關(guān)系。

2.2.1.3 供試品溶液制備 精密吸取樣品溶液10 mL，上中性氧化鋁柱，30 mL乙醇洗脫，流出液及洗脫液收集至50 mL量瓶中，乙醇定容至刻度；精密吸取10 mL，加乙醇稀釋至50 mL，搖勻，測定。

2.2.1.4 精密度試驗(yàn) 選取某一濃度的對照品溶液，連續(xù)測7次，按上述條件測定吸光度。結(jié)果精密度良好，RSD=0.46%。

2.2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選取某一濃度的對照品溶液，按上述條件測定吸光度，間隔8 h測定1次，結(jié)果24 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD=2.7%。

2.2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取樣品溶液10 mL，按“2.2.1.3”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液5份，進(jìn)行含量測定，測定結(jié)果RSD=1.3%。

2.2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 以重復(fù)性實(shí)驗(yàn)所得總生物堿平均含量為樣品溶液含量，精密吸取樣品溶液5份，加入等量對照品溶液，按“2.2.1.3”項(xiàng)下方法操作，計(jì)算總生物堿回收率為101.3%，RSD=1.07%。結(jié)果表明方法準(zhǔn)確可靠。

2.2.2 延胡索乙素的含量測定

2.2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，0.5μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH 6.4）（52∶48）；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按延胡索乙素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取延胡索乙素對照品適量，加甲醇制成1 mL含46.3μg的溶液，即得。

2.2.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取延胡索乙素對照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μL，在上述色譜條件下進(jìn)行試驗(yàn)，測定峰面積。以對照品延胡索乙素的量（X）為橫坐標(biāo)，吸收峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸處理，得回歸方程：Y=36.425X+0.28，r=0.999 4。由此可知，延胡索乙素的進(jìn)樣量在0.432 8～2.164 0μg范圍內(nèi)，其峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 選取某一濃度的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣7次，按上述條件測定峰面積。結(jié)果精密度良好，RSD=0.37%。

2.2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選取某一濃度的對照品溶液，按上述色譜條件測定峰面積，間隔6 h測定1次，結(jié)果24 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD=2.3%。

2.2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取樣品溶液10 mL，按“2.2.2.1”項(xiàng)下方法，制備樣品溶液5份，進(jìn)行含量測定，測定結(jié)果RSD=1.1%。

2.2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 以重復(fù)性實(shí)驗(yàn)所得延胡索乙素平均含量為供試品溶液含量，精密吸取供試品溶液5份，加入等量對照品溶液，按“2.2.2.1”項(xiàng)下方法操作，計(jì)算延胡索乙素回收率為101.7%，RSD=2.8%。結(jié)果表明方法準(zhǔn)確可靠。

2.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

樹脂預(yù)處理：分別取極性樹脂NKA-9、HPD600、HPD500，中等極性樹脂HPD-450、HPD-400A、HPD-400，弱極性樹脂AB-8、DM-130、D-100，非極性樹脂HPD100A、D101、D141適量于體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇（以下乙醇濃度皆為體積分?jǐn)?shù)）浸泡24 h后，濕法裝柱，并用95%乙醇動態(tài)洗脫5 BV，水洗至無醇味，依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%鹽酸（浸泡6 h后，水洗至中性）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%氫氧化鈉（浸泡6 h后，水洗至中性）處理，最后用95%乙醇動態(tài)洗脫至流出液加水（體積比1∶5）不變混濁為止，用水置換出乙醇后備用。

2.4 大孔吸附樹脂的篩選

取20 mL不同型號已處理好的樹脂分別裝入色譜柱，測定死體積后，將一定濃度樣品溶液通過樹脂柱，以相同流速1.5 BV/h進(jìn)行動態(tài)吸附，TLC檢測（Dragendorff反應(yīng)檢識生物堿，Molish反應(yīng)檢識糖或糖苷類化合物）泄漏點(diǎn)，預(yù)試藥液泄漏前的上樣體積。HPD500、NKA-9、HPD600、HPD450、HPD400A、HPD400、AB-8、DM-130、D-100、D-141、HPD100A、D101的上樣量分別為310、75、110、325、150、175、350、160、350、350、300、300 mL。結(jié)果表明，HPD500、HPD-450、AB-8、D-100、HPD100A、D101、D141 7種樹脂用于延胡索總生物堿的吸附效果較好，因此選擇這7種樹脂繼續(xù)進(jìn)一步考察。

將選擇的7種樹脂上樣后用水洗脫除雜，水洗體積為110 mL，流速為2 BV/h。觀察發(fā)現(xiàn)：D101樹脂水洗液中溶解有大量生物堿，水洗液顏色較其他樹脂明顯深很多，說明該樹脂對延胡索生物堿的吸附量較小，不宜選用。用乙醇洗脫剩下的6種上樣樹脂，合并洗脫液于500 mL量瓶中，95%乙醇定容至刻度，搖勻，測定總生物堿含量和延胡索乙素的含量。結(jié)果見表1、2。

表1 不同樹脂類型對洗液中總生物堿及延胡索乙素的篩選結(jié)果

表2 不同樹脂類型對總生物堿及延胡索乙素的篩選結(jié)果

由表1和表2結(jié)果可知，AB-8、D-141、D-100吸附量和解析率較優(yōu)，做進(jìn)一步考察。

分別取AB-8、D-141、D-100樹脂各25 mL，上樣，用TLC薄層檢測結(jié)合紫外分光光度法確定上樣量，然后用水洗除雜，再用不同濃度乙醇沖洗，結(jié)果見表3。

表3 不同樹脂類型上樣量及洗液體積的篩選結(jié)果

由表3結(jié)果可知，D-141樹脂效果較好，因此確定用D-141樹脂純化延胡索總生物堿。

2.5 吸附過程參數(shù)考察

2.5.1 上樣濃度考察

將不同濃度的上樣溶液0.25 g生藥/mL（125 mL）、0.35 g生藥/mL（90 mL）、0.5 g生藥/mL（75 mL）、0.625 g生藥/mL（50 mL），通過D141樹脂柱（樹脂水體積10 mL，徑高比1∶6），進(jìn)行動態(tài)吸附，吸附完全所用時間為3 h，每個上樣濃度接餾分10份，進(jìn)行TLC檢測，結(jié)果上樣體積分別為125、90、75、50 mL；上樣濃度為0.25 g生藥/mL在第6份泄漏生物堿，后3個濃度在第7份泄漏生物堿。考慮到上樣過程同時也是除雜過程，應(yīng)該是上樣體積越大除去的雜質(zhì)越多，從該角度考慮0.35 g生藥/mL的上樣濃度比較合適。

2.5.2 徑高比考察

選擇直徑相同的色譜柱3根，濕法裝入D141樹脂，使樹脂徑高比分別達(dá)到1∶4、1∶6、1∶10，取濃度為0.35 g生藥/mL的樣品溶液通過樹脂柱，進(jìn)行動態(tài)吸附（4 BV/h），待吸附完全后，用8 BV純凈水洗脫除雜，后用4 BV 60%乙醇+4 BV 90%乙醇洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中總堿的量及總浸膏的量，結(jié)果為樹脂徑高比分別為1∶4、1∶6、1∶10時，總浸膏量分別為541.8、549.1、459.4 mg；總生物堿量分別為312.4、329.9、321.7 mg。結(jié)果表明，選擇樹脂徑高比1∶6較好。

2.5.3 吸附流速考察

選擇直徑相同的色譜柱3根，濕法裝入D141樹脂，樹脂徑高比1∶6，取濃度為0.35 g生藥/mL的樣品溶液分別以2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h通過樹脂柱，進(jìn)行動態(tài)吸附，待吸附完全后，用8 BV純凈水洗脫除雜，后用4 BV 60%乙醇+4 BV 90%乙醇洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中總堿的量及總浸膏的量。結(jié)果為吸附流速為2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h，總浸膏量為491.6、471.1、494.6 mg，總生物堿量為319.8、316.8、316.1 mg。表明吸附流速4 BV/h較好。

2.5.4 泄漏點(diǎn)考察

取色譜柱1根，濕法裝入D141樹脂，樹脂徑高比1∶6，取濃度為0.35 g生藥/mL的樣品溶液分以4 BV/h通過樹脂柱，進(jìn)行動態(tài)吸附，接餾份10份，每份10 mL，薄層檢測，結(jié)果顯示，上樣80 mL生物堿開始泄漏，所以最大上樣量確定為80 mL。

2.6 除雜過程各參數(shù)考察

2.6.1 除雜溶劑考察

取濃度為0.35 g生藥/mL的上樣溶液80 mL，4份，分別以2 BV/h的流速通過4根大孔樹脂色譜柱（樹脂體積為10 mL，徑高比為1∶6），待吸附完全后，分別用常溫純凈水，冷藏純凈水，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% NaCl溶液（以下NaCl濃度皆為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%氨水（以下氨水濃度皆為質(zhì)量分?jǐn)?shù)））洗脫除雜，TLC檢測結(jié)合目測優(yōu)選洗脫溶劑。結(jié)果表明，常溫純凈水、冷藏純凈水和2.5%氨水洗脫液都含有生物堿，顏色都較深，而1% NaCl溶液洗脫液不含生物堿，顏色最淺。結(jié)果表明，1%NaCl溶液做除雜溶劑較好。

2.6.2 NaCl溶液洗脫濃度及洗脫體積考察

取濃度為0.35 g生藥/mL的上樣溶液80 mL，3份，分別以2 BV/h的流速通過3根大孔樹脂色譜柱（樹脂體積為10 mL，徑高比為1∶6），待吸附完全后，分別用0.3%、0.6%、1% NaCl溶液洗除雜（接除雜餾分，共接7份，前2份每份15 mL，后5份每份10 mL），TLC檢測結(jié)合目測優(yōu)洗脫溶劑濃度，確定洗脫溶劑濃度后，采用Molish反應(yīng)（檢識糖或糖苷類化合物）確定除雜體積。0.3% NaCl溶液洗脫時，洗脫30 mL（3 BV）后Molish反應(yīng)已呈陰性，說明糖已除掉，70 mL（7 BV）后已無其他雜質(zhì)洗脫下來。考慮到盡量降低NaCl的濃度和節(jié)約成本，結(jié)果為0.3% NaCl溶液較合適，洗脫體積為7 BV，再用1 BV水洗脫除掉NaCl（硝酸銀反應(yīng)檢識Cl-），最終洗脫體積為8 BV。

2.7 洗脫過程各參數(shù)考察

2.7.1 洗脫溶劑濃度考察

取濃度為0.35 g生藥/mL的上樣溶液80 mL，8份，分別以2 BV/h的流速通過8根大孔樹脂色譜柱（樹脂體積為10 mL，徑高比為1∶6），待吸附完全后，分別用0.3% NaCl溶液7 BV+純凈水1 BV洗脫除雜，然后用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%的乙醇各8 BV分別洗脫，收集洗脫液于100 mL量瓶中，并用洗脫液定容，TLC檢測以及HPLC指紋圖譜分析檢測生物堿，同時測定總生物堿含量及轉(zhuǎn)移率。結(jié)果顯示，隨著乙醇濃度的升高，洗脫液中總生物堿的含量增加，90%乙醇洗脫時最大，總生物堿的轉(zhuǎn)移率為86.95%。該結(jié)果不是很理想，繼續(xù)考察。取濃度為0.35 g生藥/mL的上樣溶液80 mL，3份，分別以2 BV/h的流速通過3根大孔樹脂色譜柱（樹脂體積為10 mL，徑高比為1∶6），待吸附完全后，分別用0.3%NaCl溶液7 BV+純凈水1 BV洗脫除雜，然后分別用4 BV 60%+4 BV 90%乙醇、4 BV 70%+4 BV 90%及4 BV 90%+4 BV 60%乙醇分別洗脫，收集洗脫液于100 mL量瓶中，并用95%乙醇定容，測定總生物堿含量及轉(zhuǎn)移率，結(jié)果出膏量分別為565.62、560.65、559.43 mg；總生物堿轉(zhuǎn)移率分別為88.11%、87.33%、87.14%；出膏率分別為11.61%、11.38%、11.31%。結(jié)果表明，4 BV 60%+4 BV 90%乙醇洗脫濃度較好。

2.7.2 洗脫流速考察

取濃度為0.35 g生藥/mL的上樣溶液80 mL，共3份，分別以4 BV/h的流速通過3根大孔吸附樹脂色譜柱（樹脂體積為10 mL，徑高比為1∶6），待吸附完全后，分別用0.3% NaCl溶液7 BV+純凈水1 BV洗脫除雜，然后用4 BV 60%+4 BV 90%的乙醇分別以4 BV/h、5.5 BV/h、8 BV/h洗脫，收集洗脫液于100 mL量瓶中，并用洗脫液定容，檢測洗脫液出膏量分別為493.9 mg、497.8 mg和488.8 mg；總生物堿的量分別為346.8 mg、398.3 mg和359.5 mg。從結(jié)果可以看出洗脫流速為5.5 BV/h時較合適。

2.7.3 洗脫體積考察

2.7.3.1 考察60%乙醇洗脫曲線 取濃度為0.35 g生藥/mL的上樣溶液80 mL，以4 BV/h的流速通過大孔樹脂色譜柱（樹脂體積為10 mL，徑高比為1∶6），待吸附完全后，用0.3%NaCl溶液7 BV+純凈水1 BV洗脫除雜，然后用8 BV 60%乙醇以5.5 BV/h洗脫，接收洗脫液，每10毫升為1份，檢測每份洗脫 液 中 總 生 物 堿 的 量 分 別 為55.9、124.75，33.7、32.0、21.3、16.8、13.0、10.8和10.1 mg。結(jié)果表明，3～4 BV洗脫較合適。

2.7.3.2 考察90%乙醇洗脫曲線 取濃度為0.35 g生藥/mL的上樣溶液100 mL，以4 BV/h的流速通過大孔樹脂色譜柱（樹脂體積為10 mL，徑高比為1∶6），待吸附完全后，用0.3%NaCl溶液7 BV+純凈水1 BV洗脫除雜，接著用4 BV 60%乙醇洗脫收集洗脫液，然后再用8 BV 90%的乙醇以5.5 BV/h洗脫，接收洗脫液，每10毫升為1份，檢測每份洗脫液中總生物堿的量分別為30.55、41.64、25.06、16.23、10.0、8.24、6.86 mg。結(jié)果顯示，4 BV洗脫較合適。

綜上所述，將洗脫體積定為60%乙醇4 BV+90%乙醇4 BV。

2.8 樹脂再生方法及使用次數(shù)考察

樹脂使用1次后，用純凈水及95%乙醇處理，進(jìn)行了11次試驗(yàn)，測定每次總生物堿的吸附量，當(dāng)總堿吸附量降低到最大吸附量的70%時，停止使用。考察結(jié)果表明：D141樹脂每次使用后用95%乙醇沖洗除雜，使用7次后總生物堿的吸附量仍能達(dá)到最大吸附量的80%。該結(jié)果表明，雖然該樹脂使用后顏色變深，但對下一步的使用影響不大。結(jié)論：D141樹脂每次使用后用95%乙醇沖洗再生處理，至少能使用7次。

2.9 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照上述確定的純化延胡索總生物堿的工藝制備3批樣品，測定總生物堿的和延胡索乙素的含量，總生物堿的轉(zhuǎn)移率和出膏率。總生物堿的含量分別為82.3%、81.1%、82.7%，平均值為82.0%；延胡索乙素的含量分別為1.09%、1.21%、1.33%，平均值為1.21%；總生物堿的轉(zhuǎn)移率分別為89.0%、88.0%、86.0%，平均值為87.7%；出膏率分別為1.81%、1.78%、1.73%，平均值為1.77%。由結(jié)果可以看出，該工藝比較穩(wěn)定，重現(xiàn)性比較好。

3 討論

在延胡索總生物堿的純化研究工藝含量測定中，文獻(xiàn)[4]報道采用延胡索乙素作為單一考察指標(biāo)進(jìn)行含量測定是不夠全面的；文獻(xiàn)[5-8]報道采用酸性染料比色法測定總生物堿，經(jīng)過作者詳細(xì)考察，此方法實(shí)驗(yàn)誤差比較大，操作也比較煩瑣，耗時較長，所得數(shù)據(jù)重復(fù)性不夠理想。本文在研究紫外方法測量總堿時，發(fā)現(xiàn)由于色素等成分的干擾，使得直接測量有些偏差，采用中性氧化鋁柱進(jìn)行純化則可有效地除去雜質(zhì)，得到較純凈的生物總堿，再進(jìn)行紫外法測定，結(jié)果較好。

在延胡索總生物堿純化工藝研究中，對于除雜溶劑，作者進(jìn)行了NaCl溶液加入順序的考察：①樣品溶液+NaCl溶液上樣；②樣品溶液上樣后，NaCl溶液洗脫后，用純凈水洗脫；③樹脂先用NaCl溶液飽和后，再上樣；④樣品溶液+NaCl溶液上樣后，再用NaCl溶液洗脫+水洗脫。測定各洗脫液中總堿的量及延胡索乙素的量，結(jié)果為①②明顯優(yōu)于③④，但②最佳。

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，確定大孔吸附樹脂純化延胡索總生物堿的純化工藝為：選擇D141大孔吸附樹脂，上樣液濃度0.35 g生藥/mL，徑高比1∶6，吸附流速4 BV/h，除雜溶劑和體積為0.3%NaCl溶液7 BV+純凈水1 BV，洗脫溶劑為4 BV60%乙醇+4 BV90%乙醇，洗脫流速為5.5 BV/h。該工藝合理、可行，適合工業(yè)生產(chǎn)。

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