免疫層析試紙條監(jiān)測實驗感染日本血吸蟲病牛治療前后抗體消長

付 媛，盧福莊，楊玉煥，俞國喬，顧 昀，馮尚連，石團員，賈會娟，張雪娟

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021;2.東北林業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150040;3.浙江省畜牧獸醫(yī)局，浙江 杭州 310020;4.河北省新樂市農(nóng)業(yè)畜牧局，河北 新樂 050700)

血吸蟲病是一種人獸共患的寄生蟲病，它寄生于人、牛、羊、豬、犬，及一些野生哺乳動物的腸系膜靜脈和門靜脈系統(tǒng)的血管內(nèi)，嚴重威脅著疫區(qū)人畜健康和生命安全，給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，被世界衛(wèi)生組織列為全球重點防治疾病之一。牛是血吸蟲的主要保蟲宿主，牛血吸蟲感染率的高低在一定程度上決定該地區(qū)血吸蟲病的流行程度。

牛血吸蟲病抗體檢測試紙條具有成本低廉，操作簡便、快速等優(yōu)點，為普查血吸蟲病牛，篩選化療目標群體提供技術(shù)手段，是低成本有效控制牛血吸蟲病疫情的重要環(huán)節(jié)［1］。采用該法對實驗感染牛血吸蟲病血清抗體進行監(jiān)測是闡明該試紙條是否具有早期診斷價值和療效參考價值的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試動物

黃牛5頭 (1～5號)，1歲半，購自湖北鐘祥血吸蟲非疫區(qū)。牛經(jīng)病原學和血清學檢查均無血吸蟲感染。

1.1.2 血吸蟲尾蚴

購自湖南岳陽血防站的陽性釘螺所釋放。每頭牛感染1 000～1 500條。

1.1.3 治療實驗感染血吸蟲病牛藥品

治療藥品為獸用吡喹酮，系南京制藥廠產(chǎn)品，批號為20060501。

1.1.4 牛血吸蟲病抗體檢測試紙條

為浙江省農(nóng)業(yè)科學院和浙江省畜牧獸醫(yī)局共同研制，批號為20101107。

1.2 方法

1.2.1 血清制備

在實驗感染血吸蟲尾蚴前，牛頸靜脈采血，制備的血清作為0周血清。牛從感染后第1周至第10周，每周采血1次，分離血清，-20℃保存。牛感染后第11周用吡喹酮進行治療，治療后第1～3周每周采血1次，治療后第4～24周，每2周采血1次，分離血清，-20℃保存。

1.2.2 實驗感染血吸蟲牛用吡喹酮治療

5頭牛于實驗感染血吸蟲后第11周時，用吡喹酮按60 mg·kg-1的劑量進行治療，每隔7 d治療1次，共治療3次。

1.2.3 血清稀釋

取潔凈1.5 mL離心管，編上對應的血清號碼，吸取血清稀釋液0.05 mL加到塑料離心管中，吸取血清0.05 mL，加入對應編號的塑料離心管中混勻后，即成2倍稀釋的血清。

1.2.4 牛感染血吸蟲前后及治療前后血清抗體檢測方法

取試紙條平放在桌面上，吸取2倍稀釋的血清0.05 mL，滴在試紙條標有箭頭前端的樣品墊上。

試紙條結(jié)果判定標準。陽性。檢測線 (T)與質(zhì)控線 (C)均出現(xiàn)清晰紅色條帶。血清中的抗體水平越高，T線顏色越深，根據(jù)T線顏色深淺可判為呈現(xiàn)濃郁的紅色條帶為強陽性，以+++表示，呈現(xiàn)清晰可見的紅色條帶，為陽性，以++表示，呈現(xiàn)淺紅色條帶為弱陽性，以+表示。

陰性。只有C線出現(xiàn)清晰可見紅色條帶，以-表示。

可疑。C線出現(xiàn)一條顏色清晰可見的紅色線，而T線出現(xiàn)一條顏色很淺，若隱若顯的紅色帶，以±表示。

無效。若檢測陽性標準血清T、C線不出現(xiàn)紅色條帶或陰性標準血清C線不出現(xiàn)紅色條帶，則該試紙條為無效。

2 結(jié)果和分析

用試紙條檢測5頭實驗感染血吸蟲后第0～10周和治療后第1～24周的牛血清中的抗體，結(jié)果從血吸蟲感染后第4～5周開始，采集的牛血清中檢測到了抗體，在感染后第8～10周及治療后第1～4周時，抗體水平達高峰，然后從治療后第6周開始，抗體逐漸下降，1，2，3，4和5號牛依次在治療后第 24，16，22，20和 20周抗體轉(zhuǎn)陰(表1)。

3 小結(jié)和討論

用牛血吸蟲病抗體檢測試紙條檢測實驗感染血吸蟲治療前后血清抗體，其中有2頭牛在實驗感染血吸蟲第4周檢測出抗體;在感染后第5周，5頭牛都檢測出血清抗體，表明該試紙條具有早期診斷的價值。在感染后第8～10周及治療后第1～4周時，抗體水平達高峰，然后從治療后第6周開始，抗體逐漸下降，說明該試紙條具有療效考核的價值。1，2，3，4和 5號牛依次在治療后 24，16，22，20和20周抗體轉(zhuǎn)陰，不同牛的抗體水平不一致可能與牛的個體差異相關(guān)。牛血吸蟲病抗體檢測試紙條具有早期診斷與療效考核價值。

用試紙條法與以免疫滲濾方法［2］和血吸蟲重組融合蛋白 (rLHD-Sj23-GST)間接 ELISA法［3］檢測人工感染牛血吸蟲抗體相比，本試紙條方法的早期診斷時間介于兩者之間，免疫滲濾法最早可以檢測到感染2周的牛血吸蟲抗體 (1/5)，而試紙條法最早可以檢測感染4～5周的牛血吸蟲抗體 (2/5)，重組融合蛋白 (rLHD-Sj23-GST)間接 ELISA法在感染后5～8周抗體顯陽性 (2/5)。3種方法在抗體的高峰期出現(xiàn)的時間上差別不大。在抗體的轉(zhuǎn)陰階段，試紙條法檢測5頭牛感染血吸蟲治療后第16～24周抗體轉(zhuǎn)陰;免疫滲濾法檢測3頭牛感染血吸蟲治療后第29～39周抗體轉(zhuǎn)陰，重組融合蛋白 (rLHD-Sj23-GST)間接ELISA法檢測5頭牛感染血吸蟲治療后第8～24周抗體轉(zhuǎn)陰。由此可見，實驗感染血吸蟲病牛血清中可檢測到的抗體陽性時間似與檢測方法的靈敏度相關(guān)。檢測方法的靈敏度高，可檢測到抗體陽性的時間較早，而在牛得到有效治療后抗體轉(zhuǎn)陰的時間則較遲;相反，檢測方法的靈敏度低，可檢測到抗體陽性的時間較遲，而在牛得到有效治療后抗體轉(zhuǎn)陰的時間則較早。

表1 用試紙條檢測實驗感染血吸蟲牛治療前后抗體消長情況

［1］ 盧福莊，付媛，趙俊龍，等.實驗感染血吸蟲牛、兔抗體的消長規(guī)律 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)學報，2009，21(4):316-320.

［2］ 李友，趙俊龍.牛血吸蟲病分子ELISA診斷方法的建立和應用 ［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學，2008.