茶樹體細胞胚的形態分析

陳曉玲，丁 菲，趙一入，江昌俊

（安徽農業大學茶葉生物化學與生物技術教育部重點實驗室，合肥230036）

體細胞胚發生作為20世紀后期植物組織培養中的一個重大發現和突破，與植物另一種再生方式即器官分化相比，具有數量多、速度快、結構完整、再生率高等優點[1]，在很多領域被廣泛應用，如作為穩定、高效的植物再生體系[2]和理想的遺傳轉化受體體系[3]。植物體胚發生的方式分直接和間接兩種：不通過愈傷組織階段直接從外植體表面或內部細胞產生體細胞胚的方式叫體胚的直接發生。先誘導出愈傷組織（直接誘導胚性愈傷，或由非胚性愈傷再轉化成胚性愈傷），體胚由胚性愈傷組織分化產生的方式叫做體胚的間接發生[4]。目前，在茶樹的組織培養中，對于體細胞胚發生的過程和不同階段的形態特征沒有詳細的報道。本文探究了茶樹體細胞胚的發生方式，描述了以茶樹子葉為外植體誘導體細胞胚發生的各個階段的形態學特征，并進行了相關細胞學分析，以期為茶樹離體再生和遺傳轉化的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

舒茶早 [C.sinensiscv.shuchazao]10月中旬的種子，采自安徽農業大學農業園。

1.2 培養基及培養條件

培養基P：MS+0.2 mg·L-1NAA+2.0 mg·L-16-BA+1.0mg·L-1GA3；蔗糖 30 g·L-1，瓊脂 0.75%，pH 5.8。白熾燈光照強度 50μmol·m-2·s-1，12h 光照，25±2℃培養。

1.3 體細胞胚的誘導

將采集的種子去除果皮，表面消毒，無菌操作下剝去種皮，將子葉切割成0.5cm2，分為帶胚子葉和不帶胚子葉兩種處理，接種于體細胞胚誘導培養基P中，30d為一周期，繼代培養。觀察體細胞胚的形成過程。

1.4 體細胞胚的細胞學觀察

取供顯微觀察的體細胞胚材料，固定于FAA中，常規石蠟切片，切片厚10μm，番紅與固綠染色，顯微鏡下觀察、攝影。

2 結果與分析

2.1 體細胞胚產生的兩種方式

子葉在體細胞胚誘導的過程中，通過兩種方式產生體細胞胚。一種是直接產生體細胞胚：帶胚子葉接種到培養基中，初代內胚萌發出胚芽胚根，隨后在子葉柄處直接產生體細胞胚，分化出芽叢（圖1-A）。直接產生體細胞胚歷時很短，從接種2代內即可發生并萌發。另一種是間接產生體細胞胚：子葉不帶胚部分在繼代培養中體積膨大，逐漸轉化成胚性愈傷組織，然后分化出體細胞胚（圖1-B）。通過間接方式產生體細胞胚時間較長，不同胚性愈傷組織的個體差異較大，繼代4～7代時，體細胞胚陸續發生。帶胚子葉可以通過直接和間接兩種方式產生體細胞胚，不帶胚子葉只通過間接方式產生體細胞胚。

圖1 體細胞胚產生的兩種方式

2.2 體細胞胚間接發生途徑各階段的形態特征

不帶胚子葉和帶胚子葉的子葉部分以間接方式產生體細胞胚。在誘導的過程中，不同階段形態特征差異較大。子葉離體培養3周左右，子葉表面產生大量的瘤狀突起（圖2-A），細胞團不斷膨大形成胚性愈傷組織，顏色由淡黃色逐漸變為綠色（圖2-B），繼代培養顏色繼續加深，至墨綠色時，其表面形成半透明顆粒狀小突起（圖2-C）即為體細胞胚，進一步培養可萌發（圖2-D），分化出芽叢（圖2-E）。綠色加深是胚性愈傷組織成熟的表現。成熟的胚性愈傷組織在繼代中，一方面分化出體細胞胚并萌發出芽，另一方面產生次級胚性愈傷組織增殖（圖2-F）。新產生的次級胚性愈傷組織黃綠色、半透明（圖2-F），分割培養不會等到完全成熟時再產生下一級胚性愈傷組織，而是成熟與增殖同時進行（圖2-G）。次級胚性愈傷組織顏色轉變為綠色時即有體細胞胚的分化（圖2-H）。

圖2 體細胞胚發生各階段的形態

2.3 體細胞胚的細胞學觀察

從形態學上觀察，綠色的胚性愈傷組織表面產生半透明的顆粒狀小突起繼續培養具有分化出芽的能力，即為體細胞胚，于是對其做了進一步的細胞學觀察。以圖2-C所示組織為材料，石蠟切片（圖3）顯示，顆粒狀突起處細胞小且排列緊密，細胞質濃，有若干個分生區域，說明此處細胞已完成脫分化，具有很強的分化能力。

圖3 體細胞胚處若干分生區域

3 討論

本研究發現茶樹體胚發生既可以通過直接方式也可以通過間接方式。2006年Seran等報道茶的體細胞胚直接從成熟胚的胚軸上產生[5]，但本實驗中只在子葉柄處發現體細胞胚的分化，胚軸上并未發現。子葉柄處直接分化出體細胞胚，可能與茶樹子葉柄本身存在胚性細胞，其表皮層或亞表皮層存在較強的器官發生潛力有關[6]。體細胞胚的間接發生途徑中，根據漸變理論[1]，茶樹子葉發生隆起是細胞脫分化、分化的標志。

體細胞胚的直接發生途徑歷時短，不經過愈傷組織階段，理論上遺傳穩定性更強；而間接發生途徑產生的體胚數量大，并且通過產生次級胚性愈傷組織繼續分化，增殖倍高。胚性愈傷組織特定時期的細胞學觀察表明，體細胞胚在胚性愈傷組織上產生，二者不能等同。在組織培養中，可以根據胚性愈傷組織的形態特征，了解其所在的發育時期，以便更好地控制離體再生體系或選擇合適時期作為遺傳轉化的受體。

[1]朱澂.植物組織培養中的胚狀體[J].遺傳學報,1978,5(1)∶79～88.

[2]Francis Wachira,Ogada,Johoson.In vitro regeneration of Camellia sinensis(L.)O.Kuntze by somatic embryogenesis[J].Plant Cell Reports,1995,14∶463～466.

[3]A.Bhattacharya T.K.Mondal, P.S.Ahuja.Transgenic tea [Camellia sinensis (L.) O.Kuntze cv.Kangra Jat]plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation of somatic embryos[J].Plant Cell Reports,2001,20∶712～720.

[4]周秀梅.牡丹體細胞胚胎發生研究[D].北京∶北京林業大學,2008.

[5]Seran Thayamini H,Hirimburegamak,Gunasekare.T.K.Direct somatic embryogenesis from explants obtained from in vitro germinated embryonic axes of Camellia sinensis(L.)O.Kuntze[J].Journal of horticultural science&biotechnology,2006,81(5)∶883～890.

[6]劉德華，周帶娣，熊格生.茶樹體細胞植株再生的光照效應[J].湖南農業大學學報,1999,25(2)∶112～115.