草酸對微生物還原高嶺土中鐵的作用機制

何秋香，郭敏容，陳祖亮

1.福建農林大學資源與環境學院，福建 福州 350002

2.福建省龍巖高嶺土有限公司，福建 龍巖 364000

3.福建師范大學化學與材料學院，福建 福州 350007

高嶺土是一種重要的非金屬礦物，具有良好的可塑性、耐火性、分散性，其廣泛用于造紙、陶瓷、搪瓷、耐火材料、化學、環保、農業等領域［1］。自然界中，高嶺土因含某些著色雜質而影響其自然白度和燒成白度，其中以三價氧化鐵形式存在的鐵礦物是最常見的雜質。目前常見的除鐵方法主要有物理法和化學法，物理法(物理分選)對提高高嶺土的白度和雜質的脫出有一定的局限性［2］;化學法是利用高嶺土本身的分散性及吸附的色素離子的物化特性，用特定的化學試劑與高嶺土反應，通過漂洗、過濾，去除色素離子，來提高產品白度［3］。化學法雖然可以有效去除這些雜質，但成本較高，且容易出現二次污染，此外，有些化學物質還可能影響高嶺土的理化性質［4］。研究發現，用硫酸和鹽酸加溫除鐵時，雖然可提高白度，但會導致高嶺土晶格的破壞，難以保持高嶺土的晶型和物理性能［5］。楊曉杰等［6］對高嶺土浸出除鐵試驗的研究發現，鐵的溶解分為兩個階段:第一階段溶解速度很快，主要為樣品中存在的可溶性鐵氧化礦物的溶出;第二階段溶解速度很慢，主要為鋁硅酸鹽礦物晶格中呈類質同象替代的微量鐵質的溶解。

研究發現，高嶺土中Fe(Ⅲ)的去除主要有微生物除鐵法和有機酸除鐵增白法［7］。微生物除鐵法［8］通過微生物代謝糖類產生不同的有機酸如草酸、檸檬酸等來實現除鐵過程;有機酸除鐵法常用的是草酸，草酸除鐵工藝國內外已經有很多研究。王平［9］在高嶺土中加入5%～10%的草酸，100℃水浴加熱1.5 h，高嶺土白度由79.5%提高至85%;進一步的研究表明，草酸能在不影響高嶺土晶格結構和物理化學性質的條件下溶解礦物表面與晶格聯系最牢固的鐵離子。Panias等［10］研究草酸的作用機理和鐵溶解動力學，證明草酸與礦粒表面的Fe(Ⅲ)反應生成幾種絡合物，草酸浸鐵過程中形成表面絡合物的溶解機理有別于無機酸對鐵礦物的溶解。筆者通過微生物試驗和化學試驗，比較了草酸濃度對微生物以及化學還原高嶺土中Fe(Ⅲ)所起的作用，同時利用ESEM，EDS等分析手段觀察微生物處理和化學處理前后礦物形貌和結構的變化，以期為高嶺土除鐵提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用高嶺土由福建龍巖高嶺土有限公司提供。該高嶺土自然白度60.8%，1280℃燒成白度83.8%，325目(粒徑為46 μm)，水洗。其主要化學成分:Al2O3，37.11%;Fe2O3，0.96%;K2O，0.38%;Na2O，0.01%;SiO2，48.50%;TiO2，0.18%;CaO，0.01%;MgO，0.01%;燒失量，12.83%。為了保證樣品干燥，使用前經105℃烘干處理，在干燥器中自然冷卻至室溫［11］。

從高嶺土中篩選出鐵還原菌(DIRB)，以其作為菌種。經16S rRNA測序，鑒定該菌種為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus/Bacillus thuringiensis)，球狀芽孢桿菌(Lysinibacillus sphaericus/Bacillus sphaericus)和蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides)的混合菌［12］。

基礎培養液:5.0 g牛肉膏，10.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，1000 mL 蒸餾水，調節 pH 為7.0～7.2，于121℃滅菌20 min。用于培養鐵還原菌富集菌液［12］。

1.2 方法

根據Guo等［12］的研究得出混合菌還原高嶺土中Fe(Ⅲ)的最佳條件:礦漿濃度為10%，菌液加入量為5%，溫度為30℃，pH為6，時間為7～10 d，葡萄糖為1 g。采用厭氧培養的方法，按照添加和不添加微生物以及不同草酸濃度，進行高嶺土中Fe(Ⅲ)還原試驗。為了獲取單因素的影響結果，試驗中未添加任何氮源、鉀鹽等。

1.2.1 微生物處理

250 mL錐形瓶中各加入10 g的高嶺土，1 g的葡萄糖，100 mL蒸餾水，添加草酸制成不同草酸濃度(分別為 0，0.1，0.2，0.3，1.0 和 1.5 g/L)的高嶺土培養液。各高嶺土培養液于121℃高溫滅菌20 min，冷卻至室溫，在潔凈工作臺接種，各加入5 mL的鐵還原菌富集菌液(A600為0.5)，向錐形瓶內充氮氣以除去殘留的氧氣，瓶口用橡膠塞密封，通過橡膠塞用注射器收集反應過程中產生的氣體，置于30℃生化培養箱中培養10 d，每個條件做三個平行樣。每天測定一次Fe(Ⅲ)還原量，連續測10 d，探討草酸濃度對微生物還原高嶺土中Fe(Ⅲ)的影響，以及微生物處理高嶺土中Fe(Ⅲ)還原量隨時間的變化。

1.2.2 化學處理

250 mL錐形瓶中各加入10 g高嶺土，100 mL蒸餾水，添加草酸制成不同草酸濃度(分別為1.0，1.5，9.0和13.0 g/L)的高嶺土培養液，于121℃高溫滅菌20 min，冷卻至室溫，置于30℃生化培養箱中培養10 d，每個條件做三個平行樣。培養期間每天測定一次Fe(Ⅲ)還原量，連續測10 d，探討草酸濃度對高嶺土中Fe(Ⅲ)還原量隨時間變化的影響。

化學處理試驗期間同時測定溶液中pH和ORP。

1.2.3 微生物處理和化學處理前后高嶺土的表征

1.2.3.1 環境掃描電鏡(ESEM)分析

利用荷蘭Philips-FEI公司/XL30環境掃描電鏡［11］表征微生物和化學處理前后高嶺土的微觀結構，分析處理前后高嶺土的形貌變化。

1.2.3.2 能譜儀(EDS)分析

EDS是根據不同元素的X射線光子特征能量不同對成分做的一種定性半定量分析，采用EDS分析微生物處理和化學處理前后高嶺土礦物微觀區域的元素分布。

1.3 測試方法

Fe(Ⅲ)還原量的測定:采用鄰菲啰啉分光光度法［13］測定溶液中的總鐵，用Fe(Ⅱ)濃度表示。取3 mL反應后高嶺土培養液，經3500 r/min離心5 min，吸取0.2 mL上清液至25 mL比色管中，加入鹽酸羥胺溶液1 mL，NaAc-HAc緩沖溶液5 mL，鄰菲啰啉試劑3 mL，加水至刻度線，搖勻。顯色10～15 min，在波長為510 nm處測量吸光度(722N型可見光光度計，上海精密科學儀器有限公司)。根據標準工作曲線(y=5.3117x-0.0002)，計算高嶺土中Fe(Ⅲ)的還原量。

菌體的定量:采用722N型可見光光度計測定A600。

pH和ORP采用精密pH計(PHS-3C型，上海精密科學儀器有限公司)和氧化還原電位(ORP)測定儀(ORP-421型，上海康儀儀器有限公司)測定。

2 結果和討論

2.1 草酸濃度對微生物還原Fe(Ⅲ)的影響

筆者前期試驗結果表明，草酸對Fe(Ⅲ)還原的促進作用比較明顯［14］，許多文獻表明草酸是微生物代謝過程中可能產生的有機酸之一［1，15-17］。以不添加草酸的異化鐵還原菌(DIRB)組作為對照，探討了草酸濃度對微生物還原高嶺土中Fe(Ⅲ)的影響，結果如圖1所示。

圖1 草酸濃度對微生物還原Fe(Ⅲ)的影響Fig.1 Effect of different concentration of oxalic acid on iron content leached

由圖1可知，與對照(0 g/L)相比，在微生物存在的情況下，加入0.2 g/L草酸時Fe(Ⅲ)的還原量最大(3.6 mg/g)，草酸濃度過高或過低對Fe(Ⅲ)的還原都有抑制(還原量低于對照)，當草酸濃度為1.5 g/L時Fe(Ⅲ)的還原被抑制，Fe(Ⅲ)還原量最低。草酸具有良好的傳遞電子能力，可以作為微生物的電子傳遞體，一些鐵還原菌不但可利用纖維素等有機物，還可利用各種有機酸和烴類化合物及芳香族化合物作為能源，草酸也可以作為微生物可利用的碳源［18］。所以當溶液中存在低濃度草酸時，微生物可以利用草酸作為生長需要的碳源，此時微生物的活性提高，Fe(Ⅲ)的還原量增加;而當草酸濃度為1.5 g/L時，由于溶液中pH過低，微生物的生長活性被抑制。有研究［1］表明，草酸濃度低時高嶺土中Fe(Ⅲ)與草酸的絡合作用不明顯，高嶺土培養液中檢測到的Fe(Ⅱ)是由于草酸的浸出作用所致。

草酸濃度對微生物和化學還原高嶺土中Fe(Ⅲ)的影響如圖2所示。由圖2可知，草酸濃度為1.0～1.5 g/L是微生物活性的分界點，對比草酸濃度為1.5 g/L時微生物處理和化學處理發現，草酸完全抑制了微生物的活性，其微生物處理和化學處理的Fe(Ⅲ)還原量相當;草酸濃度為1.0 g/L時微生物處理較化學處理的Fe(Ⅲ)還原量高，但和對照相比Fe(Ⅲ)還原量降低很多，說明微生物在草酸濃度為1.0 g/L時仍有活性，此時化學浸出作用不明顯，草酸濃度達到1.5 g/L時微生物的活性完全被抑制，轉為化學浸出作用。

從圖2(a)可以發現，對照及草酸濃度為0.1～0.3 g/L時，Fe(Ⅲ)的還原量從第2天起到第8天迅速增加，草酸濃度為0.2 g/L時對Fe(Ⅲ)的還原作用最好，而草酸濃度為0.1和0.3 g/L都對Fe(Ⅲ)的還原有輕微的抑制作用。當草酸濃度為1.0 g/L時，抑制作用明顯，草酸濃度達到1.5 g/L時，完全抑制了微生物的活性，溶液中僅為化學浸出作用。

圖2 草酸濃度對微生物和化學還原高嶺土中Fe(Ⅲ)的影響Fig.2 The effect of different concentration of oxalic acid on iron impurity reducing with chemical and biological methods

在草酸濃度較高時，由于酸度過高不適于該鐵還原菌的存活，則以化學作用為主。黃念東等［19］的研究表明:當pH大于1.2時，由于鐵不能以離子的形式存在，難與草酸形成絡合物，所以除鐵效果差;而當pH小于1.2時，用鹽酸溶液進行浸出，溶液中的含鐵量僅為28 mg/L，說明草酸的高浸鐵能力是草酸根具有絡合能力決定的，并不是鹽酸作用所致，鹽酸在此的主要作用是控制溶液的pH［19］。化學浸出試驗〔圖2(b)〕發現，隨著草酸濃度的增大，Fe(Ⅲ)的還原量也逐漸增加，當草酸濃度達到13.0 g/L時，1天后Fe(Ⅲ)還原量與微生物處理4天后Fe(Ⅲ)還原量相當。其原因是還原量隨草酸濃度增加，根據絡合反應3C2O24-+Fe3+→［Fe(C2O4)3］3-可知，溶解1 mol/L Fe(Ⅲ)需要3 mol/L草酸根離子［19］，所以草酸濃度越高，溶鐵能力越強。

圖3反映了Fe(Ⅲ)溶出過程中溶液中pH和ORP隨時間的變化。由圖3(a)可知:當溶液中有微生物發酵作用時［20］，隨著反應的進行，對照組 pH由初始的5.30降為4.20左右，而草酸濃度為1.0 g/L的試驗組，其pH由初始3.84升高到4.10，5 d后兩組pH基本都維持為4.15，與筆者前期對小分子有機酸的研究結果相同［14］，說明微生物在代謝糖類的過程中產生HCO3-和H+，隨著反應的進行，有機酸的累積和緩沖作用使得pH保持不變［21］;此外，草酸濃度為1.5和13.0 g/L的化學浸出試驗，由于沒有微生物的代謝作用，其pH在Fe(Ⅲ)還原過程中維持在3.50和1.50，基本不發生變化。

圖3 化學處理高嶺土培養液中pH和ORP隨時間的變化Fig.3 The variations of pH and ORP with chemical method

由圖3(b)可知，在濃度為1.5和13.0 g/L草酸的化學浸出試驗中，隨著作用時間的延長，Fe(Ⅲ)的浸出量逐漸增加，顯示ORP的變化趨勢與pH的變化趨勢相吻合。可能是有機酸把不溶性的氧化鐵溶解為可溶性的鐵，溶液中并未發生生物還原，溶液的pH及ORP基本維持恒定，ORP＞200 mV。而對照組及草酸濃度為1.0 g/L的微生物試驗，由于微生物的生長和對碳源的代謝作用，使溶液的pH發生變化，同時使ORP降至-450 mV，微環境逐漸轉為還原態［20］，有利于 Fe(Ⅲ)還原。

2.2 處理前后高嶺土的特性

2.2.1 ESEM表征

微生物處理和化學處理前后高嶺土結構的掃描電鏡如圖4所示。

圖4 高嶺土掃描電鏡Fig.4 Environmental scanning electron microscopy(ESEM)

從圖4(a)可以看出，高嶺土塊狀結構較多，針狀結構少;從圖4(b)可以看出，微生物處理后礦物塊狀結構基本變為針狀結構，這可能是高嶺土晶體浸泡、解離、散開造成的，沒有次生礦物產生［12］;從圖4(c)可以看出，高嶺土仍可看見清晰的片狀結構，表面分布比較多的針狀結構;從圖4(d)可以看出，化學作用后多為針狀結構，片狀結構分布較少。有研究［22］表明，微生物能夠大大加快礦物風化和轉化反應的進程，鎢礦石經硅酸鹽細菌作用8 d，有9%的鎢被溶出，進一步通過掃描電鏡分析發現，經硅酸鹽細菌作用后，礦物邊緣模糊不清，表面凹凸不平，有明顯溶蝕痕跡，而未被作用的顆粒則棱角分明。所以在微生物與高嶺土作用的過程中，微生物使塊狀晶體破碎，其對礦物的生物風化作用促使高嶺土向次生礦物轉化［16］。但由于風化時間較短，DIRB還未使礦物轉化為次生礦物［23］。

2.2.2 EDS分析

微生物處理和化學處理前后高嶺土的EDS分析如圖5所示。

圖5 高嶺土在微生物和化學處理前后的能譜Fig.5 Energy-dispersion microanalysis(EDS)

從圖5(a)和圖5(b)可以看出，礦物中存在著Si，Al，O，Mg，Na，Fe 和 C 等，其中高嶺土微生物處理前后主要元素成分和處理前大致一樣，并沒有發生很大的變化，而Fe(Ⅲ)濃度明顯減少，由0.39%降為0.22%;從圖5(b)和圖5(c)對比發現，礦物經過微生物添加0.2 g/L草酸處理后主要成分和圖5(b)相差不大，但圖5(c)基本沒有檢測到鐵元素的能譜，說明在0.2 g/L草酸微生物處理后Fe(Ⅲ)的還原效果更明顯;從圖5(d)可以看出，成分中C的濃度明顯減少，Fe(Ⅲ)濃度由0.39%降為0.26%，這表明生物還原能在不破壞礦物結構的情況下有效地減少Fe(Ⅲ)，而草酸的化學浸出作用與鹽酸、硫酸等強酸溶劑的酸浸漂白法相比，具有一定的優勢，它能在不破壞礦物重要成分的情況下，在較短的時間內去除高嶺土中的Fe(Ⅲ)。

3 結論

(1)在微生物存在的情況下加入濃度為0.2 g/L的草酸，對Fe(Ⅲ)的還原效果最好，草酸濃度過高或過低都對Fe(Ⅲ)的還原有抑制作用，當草酸濃度為1.5 g/L時，微生物活性完全被抑制，此時Fe(Ⅲ)的還原量最低。

(2)化學浸出作用隨著草酸濃度的增加，浸出量逐漸增大，當草酸濃度達到13.0 g/L時，化學處理1天后Fe(Ⅲ)的還原量與微生物處理4天后相當。

(3)經過EDS，ESEM對高嶺土微生物和化學處理前后的掃描比較，表明微生物可以侵入高嶺土的內部結構，并將內部的鐵去除，高嶺土鐵的生物還原可能是礦物的生物風化過程;高嶺土添加草酸的微生物處理法結合了傳統的化學漂白法的時間短、速度快和微生物還原法的常溫下處理，具有不改變礦物化學結構和主要成分的優點，應用前景很好。

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