厄貝沙坦對巨噬細胞凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體（LOX-1）基因及蛋白表達的影響

林令君，王曉俐，張緒洪，呂曉霞，田洪波，朱艷麗

（山東大學附屬省立醫院1.心血管科 ；2.老年心血管科；3.中心實驗室，山東 濟南 250021）

厄貝沙坦對巨噬細胞凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體（LOX-1）基因及蛋白表達的影響

林令君1，王曉俐*2，張緒洪1，呂曉霞3，田洪波1，朱艷麗2

（山東大學附屬省立醫院1.心血管科 ；2.老年心血管科；3.中心實驗室，山東 濟南 250021）

目的 研究不同濃度厄貝沙坦對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的人單核/巨噬細胞系（THP-1）凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體（LOX-1）mRNA和蛋白表達的影響，并探討其可能的機制。 方法 THP-1細胞經0.16μmoL/L佛波酯誘導分化后，將細胞分為3組：對照組、AngⅡ組、厄貝沙坦干預組，干預組分別加入不同濃度厄貝沙坦孵育2 h后，再加入AngⅡ1×10-6moL/L孵育24 h，用熒光定量PCR和細胞酶聯免疫法檢測（LOX-1）mRNA和蛋白表達。結果 與對照組比較，Ang II可明顯上調THP 1細胞（LOX-1）mRNA和蛋白表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。不同濃度厄貝沙坦均能抑制（LOX-1）蛋白表達（P＜0.05），并且隨著厄貝沙坦濃度降低，抑制作用減低，即兩者呈濃度依賴性。結論 厄貝沙坦以濃度依賴方式抑制AngⅡ誘導的THP 1細胞（LOX-1）mRNA和蛋白表達，減少巨噬細胞通過（LOX-1）途徑的氧化低密度脂蛋白（oxLDL）攝入，影響泡沫細胞的發生、發展，發揮其抗動脈粥樣硬化（AS）作用。

厄貝沙坦；人單核/巨噬細胞系；凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體

動脈粥樣硬化（Atheroslerosis，AS）是心血管疾病的基礎病理改變，研究證實，血管緊張素II（angiotensinⅡ，AngⅡ）及其受體在AS形成中有重要作用，AngⅡ1型受體拮抗劑（angiotensinⅡ1 type receptor blockers，ARB）可通過多條途徑減緩或逆轉AS[1-2]。本研究旨在進一步研究厄貝沙坦（Irbesartan）對AngⅡ誘導的THP 1細胞（LOX-1）基因和蛋白表達的影響，以探討Irbesartan在抗AS中的地位和作用，并為Irbesartan的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人單核/巨噬細胞株（THP-1細胞）購自中國科學院上海細胞庫，AngⅡ購自上海肽仕生物有限公司；厄貝沙坦由賽諾菲安萬特制藥有限公司提供；佛波酯（PMA）購自Sigma公司；RPMI-1640培養基購自美國 Hyclone公司；胎牛血清購自TBD公司；Trizol RNA提取試劑、PCR引物、逆轉錄試劑盒及PCR試劑盒均購買自大連寶生物公司；兔抗人LOX-1多克隆抗體購自abcam公司；山羊抗兔二抗及酶聯物購自北京中杉金橋生物有限公司；其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 細胞培養及實驗分組

1.2.1 THP-1細胞的培養和誘導轉化 THP 1細胞置于含10%胎牛血清RPMI-1640培養基中，37℃、5% CO2孵箱內培養。誘導轉化時加0.16μmoL/L PMA72 h以促使單核細胞分化成巨噬細胞，之后用PBS洗滌兩遍，置于無PMA及血清的RPMI-1640培養液中24 h，開始后續試驗。

1.2.2 試驗分組 對照組：培養基；AngⅡ組：分別加入1×10-6moL/、1×10-7moL/L、1×10-8moL/L、1×10-9moL/L AngⅡ作用24 h；厄貝沙坦干預組：分別加入1μmoL/L，0.1μmoL/L，0.01μmoL/L的厄貝沙坦預先孵育2 h后，再加入1×10-6moL/L AngⅡ作用24 h。

1.3 熒光定量PCR檢測（LOX-1）mRNA表達

1.3.1 RNA提取 各組培養皿中分別加入1 mL Trizol RNA提取試劑，按照說明書操作，依次經過氯仿處理，異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌后，略干燥，溶于DEPC處理水。經核酸紫外分析儀檢測，確定樣品中RNA純度（A260/A280=1.80～2.00）和濃度。

1.3.2 逆轉錄反應 應用ABI PRISM 7500 Realtime PCR System 操作，PCR引物由大連寶生物公司合成，以GAPDH為內參。LOX-1引物序列：上游5′T TA C T C T C C AT G G T G G T G C C3′,下游5′AGCTTCTTCTGCTTGTTGCC3′,產物193 bp；GAPDH引物序列：上游5′GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3′,下游5′TGGTGAAGACGCCAGTGGA3′，產物138bp。建立20μL反應體系，含SYBR Premix Ex Taq 10μL，上下游引物各0.4μL，ROX Reference DyeⅡ0.4μL，逆轉錄產物2μL，滅菌蒸餾水6.8μL。擴增條件為：①95℃變性30 s；

1.4 細胞酶聯免疫法檢查LOX-1蛋白表達

參考Yang等[3]方法并加以改動。將THP-1細胞于96孔板培養，經PMA誘導轉化、加藥物干預，每個觀察值設3個復孔，藥物作用達預定時間后棄掉培養液，用PBS清洗，4%多聚甲醛固定20min，脫脂奶粉封閉30min，加兔抗人LOX-1多克隆抗體37℃ 孵育2 h，生物素化山羊抗兔IgG 37℃ 孵育1 h，酶聯物37℃ 孵育1 h，加入TMB顯色15min,終止液終止反應，用450 nm酶標儀測吸光度（A）。結果以A450表示LOX-1蛋白表達水平。

1.5 數據處理及統計學分析

熒光定量PCR反應后的數據應用2-△△Ct進行處理，2-△△Ct 表示目的值相對于參照值的相對倍數。用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，實驗數據以“”表示，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 THP-1細胞分化成巨噬細胞

THP-1細胞呈圓形、懸浮生長，經 0.16μmoL/L PMA誘導分化72 h后，由懸浮生長變為貼壁生長，形狀不規則，且伸展偽足，呈現巨噬細胞外形。見圖1。

圖1 THP-1細胞PMA誘導分化前后形態學變化光鏡圖

2.2 AngⅡ對THP-1細胞（LOX-1）mRNA和蛋白表達的影響

以GAPDH為內參照，進行熒光定量PCR，擴增曲線呈典型的S型曲線，融解曲線分析可見只有單峰值，排除了非特異性擴增。用細胞酶聯免疫法檢測TH-1細胞（LOX-1）蛋白表達。不同濃度AngⅡ均可明顯上調THP-1細胞（LOX-1）mRNA和蛋白表達，隨著AngⅡ濃度的增加，其（LOX-1）mRNA和蛋白表達也增加，呈濃度依賴性，差異有統計學意義（P＜0.05）。 結果如圖2-3所示。

2.3 厄貝沙坦對AngⅡ誘導的THP 1細胞（LOX-1）mRNA和蛋白表達的影響

分別加入1μmol/L、0.1μmol/L、0.01μmol/L不同濃度的厄貝沙坦預先孵育2 h后，再加入1×10-6moL/L AngⅡ作用24 h，用熒光定量PCR法和細胞酶聯免疫法檢測由AngⅡ誘導的THP-1細胞LOX-1mRNA和蛋白的表達。濃度分別為1μmol/L、0.1μmol/L、0.01μmol/L各厄貝沙坦組THP-1細胞LOX-1mRNA和蛋白表達均有不同程度下降，各厄貝沙坦組間兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.01）。結果表明不同濃度厄貝沙坦均能抑制由AngⅡ誘導的THP 1細胞LOX-1基因和蛋白表達，并且隨著厄貝沙坦濃度降低，其抑制作用減弱，兩者呈濃度依賴性。結果見圖4-5。

圖2 Ang II對誘導分化后THP-1細胞（LOX-1）mRNA 表達的影響

圖3 Ang II對誘導分化后THP-1細胞（LOX-1）蛋白表達的影響

圖4 厄貝沙坦對THP-1細胞（LOX-1）mRNA表達的影響

圖5 厄貝沙坦對THP-1細胞LOX-1 蛋白表達的影響

3 討論

泡沫細胞的形成是AS發生、發展關鍵，它主要源于血液中單核細胞轉變成巨噬細胞，通過清道夫受體攝取氧化型低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL）后轉變而來。凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體（Lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor 1，LOX-1）是sawamura[4]等在1997年首次在牛內皮細胞上發現Ox-LDL的受體，為Ⅱ型膜蛋白，結構上屬于C型血凝集素家族，能夠特異性地結合、吞噬和降解Ox-LDL。

AngII是重要致AS因子，不僅存在于循環中，局部組織及細胞中也大量存在[5]。在本實驗中，我們發現AngⅡ伴隨濃度增加，可明顯上調THP-1細胞（LOX-1）mRNA和蛋白表達，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。

厄貝沙坦（Irbesartan）是一種非肽類血管緊張素Ⅱ（Ang II）受體（AT）拮抗劑，它與AT1受體有高度的親和性，而不與AT2受體結合，是非競爭性AT1受體阻斷劑。

本研究我們采用體外培養人單核/巨噬細胞系作研究對象，首次觀察不同濃度厄貝沙坦對AngⅡ誘導的THP-1細胞LOX-1基因轉錄和蛋白表達的影響。結果發現：各厄貝沙坦組均能抑制AngⅡ誘導的巨噬細胞LOX-1基因轉錄和蛋白表達，差異有統計學意義（P＜0.05）；隨著厄貝沙坦濃度減低，抑制作用也逐漸減弱，兩者呈濃度依賴性。而1 umoL/L厄貝沙坦則能完全抑制AngⅡ誘導的巨噬細胞LOX-1基因轉錄和蛋白表達，使LOX-1基因轉錄和蛋白水平接近正常對照組（P＞0.05）。提示厄貝沙坦能夠以濃度依賴方式，抑制AngⅡ誘導的THP 1細胞LOX-1基因轉錄和蛋白表達。

[1]Gillis JC,Markham A,Irbesartan.A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and therapeutic use in the management of hypertension[J].Drugs,1997,54(6):885-902.

[2]Hanefeld M,Abletshauser C.Effect of the angiotensin II recept or antagonist valsartan on lipid profile and glucose metabolism in patients with hypertension[J].J Int Med Res,2001,29(4):270-279.

[3]Yang XY,Jiang HG,Hartmann WK.Development of a quantitative antigenspecific cell based ELISA for the 7G7/B6 monoclonal antibody directed toward IL-2Ra[J].Journal of Immunological Methods,2003,277(1):87-100.

[4]Sawamura T,Kume N,Aoyama T,et al.An endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein[J].Nature,1997,386(6620):73-77.

[5]Madamanchi NR,Vendrov A,Runge MS.Oxidative stress and vascular disease[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2005,25(1):29-38.

Effects of irbesartan on expression of lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 mRNA and protein in cultured THP-1 cells

LIN Ling-jun1,WANG Xiao-li2,ZHANG Xu-hong1,LV Xiao-xia3,TIAN Hong-bo1,ZHU Yan-li2
(1.Department of Cardiology;2.Depatment of Geriatric Cardiology;3.Central laboratory,Provincial Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan,Shandong 250021,China)

Irbesartan;THP-1;LOX-1

R963

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2012.08.003.007.03

〔Absrract〕Objective To investigate the influence of irbesartan on expression of lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 mRNA and protein in cultured THP-1 cells Methods THP-1 cells were differentiated by incubation with 160nM PMA for 72 hours.The cells were divided into three groups:control group, AngⅡgroup and irbesartan intervention group. The intervention groups were first treated with several concentration irbesartan for 2 hours, then coincubated with AngⅡ1×10-6moL/L for24h. Real time PCR and enzyme-linked immunosorbent assay technology were used to detect (LOX-1) mRNA and protein expression.Results AngⅡ induced the increase of THP-1 (LOX-1) mRNA and protein expression(P＜0.05). Several concentration irbesartan groups blocked AngⅡ-induced (LOX-1) mRNA and protein expression,The decrease in (LOX-1) expression was dependent on irbesartan concentration. Conclusion Irbesartan can blocke AngⅡ-induced( LOX-1) mRNA and protein expression in a concentration-dependent and reduce intake of macrophages on the oxidized low density lipoprotei via (LOX-1) pathway, affecting the foam cell development,exert their effect on anti-atherosclerosis.

2012－02－21

山東省自然科學基金（Y2006C129）。

林令君（1983－），女，山東人，碩士研究生，主要研究老年心血管疾病臨床診斷與治療。

*王曉俐，主任醫師，E-mail：wangxiaoli3@medmail.com.cn。

(本文編輯: 韓志濤)