甲醛滴定法測定牛血清白蛋白的酶解度

王劍鋒，孫 爽，李 瑤，蓋明昊，肖 龍，張 坤，劉寶全，范圣第

(大連民族學院生物化學工程國家民委－教育部重點實驗室，遼寧大連 116605)

甲醛滴定法測定牛血清白蛋白的酶解度

王劍鋒，孫 爽，李 瑤，蓋明昊，肖 龍，張 坤，劉寶全，范圣第

(大連民族學院生物化學工程國家民委－教育部重點實驗室，遼寧大連 116605)

針對作者前期提出的蛋白質酶解度定義，發展了一種利用甲醛滴定實驗測定蛋白質酶解度的方法。分別利用甘氨酸與賴氨酸研究了α位游離氨基和ε位游離氨基在甲醛滴定實驗中的測量狀況，結果表明，甲醛滴定法測量結果比實際值偏低，進而利用修正系數對測定結果進行校正，確定甘氨酸、賴氨酸與牛血清白蛋白的修正系數分別為0.797，1.292和52.47，利用甲醛滴定法測定并計算出胰蛋白酶對底物牛血清白蛋白在本實驗特定酶解條件下的酶解度為22.7。

酶解度;甲醛滴定法;蛋白質;酶;水解

蛋白質酶解技術已經廣泛應用于食品、藥品、美容等領域，一系列功能多肽相繼被發現、分離純化和廣泛應用，如降壓肽、美容肽等。利用蛋白質酶解技術生產功能多肽，其核心工作是優化酶解條件和控制蛋白質的酶解程度。由于蛋白質酶解的實質就是多肽鏈中的肽鍵在蛋白酶的作用下發生水解并不斷形成新的多肽鏈的過程，因此可以基于多肽鏈數目變化定義蛋白質的酶解過程。本文作者從多肽鏈數目變化的角度考察了蛋白質的酶解過程，提出了蛋白質酶解度(Degree of enzymatic hydrolysis，DEH)的概念［1］，即將蛋白質酶解體系中新增肽鏈總數與酶解前肽鏈總數的比值定義為酶解度;并發展了一種利用游離氨基測定蛋白質酶解度的方法。

測定游離氨基的方法有很多種［2－6］，如三硝基苯磺酸法、鄰苯二甲醛法、水合茚三酮法、甲醛滴定法等。其中甲醛滴定法是測定游離氨基的最常用方法之一。針對甲醛滴定法測量結果受多肽鏈中氨基酸側鏈氨基干擾和測量中存在的結果偏低問題，本文作者利用修正系數進行校正，將甲醛滴定法測定的游離氨基的物質的量與體系中蛋白質(多肽或氨基酸)物質的量的比值定義為修正系數，用以對甲醛滴定法測定蛋白質酶解度的方法進行補充與完善。

1 材料與方法

1.1 材料

牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin V，下稱BSA)，純度 ＞98%(Sanland Chemical公司);胰蛋白酶(Trypsin)(1∶250)(Amresco公司產品);酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉及其他試劑均為國產分析純;實驗用水為自制雙蒸水。

1.2 甲醛滴定與游離氨基的計算

準確稱取5.000 0 g BSA，用酶解緩沖液(10 mmol·L－1磷酸鹽緩沖液(pH7.0))溶解后，定容到1 L。

分別取10 mL BSA溶液與10 mL酶解緩沖液、5 mL雙蒸水、0.75 mL酚酞指示劑充分混合，用標定的堿液小心滴定至終點，記錄滴定到終點所耗用的標定堿液的體積VCK－BSA。重復3次，取平均值。用0.01 mol·L－1的甘氨酸溶液替代雙蒸水，用酶解緩沖液代替BSA溶液，測得VCK－Gly;用同樣方法獲得賴氨酸滴定消耗的堿液體積VCK－Lys。

甲醛滴定:按5 mL甲醛、0.75 mL酚酞指示劑的比例，將二者混合均勻后，用堿液滴定到終點，獲得中和甲醛。向其中分別加入10 mL BSA溶液與10 mL酶解緩沖液、5 mL雙蒸水，充分混合后，用標定的堿液小心滴定至終點，記錄滴定到終點所耗用的標定堿液的體積VFormol－BSA。重復3次，取平均值用于計算。用0.01 mol·L－1的甘氨酸溶液替代雙蒸水，用酶解緩沖液替代BSA溶液，測得VFormol－Gly;用同樣方法獲得賴氨酸滴定消耗的堿液體積VFormol－ Lys。

根據甲醛滴定法的基本原理，即滴定所消

耗的標定堿的物質的量就是體系中游離氨基的物質的量，利用 VFormol－BSA、VCK－BSA和標定的堿液的濃度NNaOH，可以計算出體系中 BSA的游離氨基的總物質的量。

式中，ANFormol－BSA為10 mL BSA溶液體系中的游離氨基總物質的量，NNaOH為標定的NaOH溶液的濃度。

根據操作1.2的測定結果，利用式(1)分別計算出特定體積的BSA溶液、甘氨酸溶液、賴氨酸溶液 中 的 游 離 氨 基 數 ANFormol－BSA、ANFormol－Gly、ANFormol－Lys。本文中將 BSA 溶液、甘氨酸溶液、賴氨酸溶液的修正系數分別用KBSA、KGly、KLys表示，以BSA為例，其修正系數KBSA的計算式為

式中，ANFormol－BSA為BSA溶液中甲醛滴定法測定的游離氨基物質的量(測量值)，AN0(BSA)為實驗體系中BSA的初始物質的量(理論值)。

1.3 酶解度的測定

準確稱取0.020 0 g胰蛋白酶(Trypsin)，用酶解緩沖液(同1.2)溶解后，定容到0.1 L。取5 mL甲醛溶液，加入0.75 mL酚酞指示劑，加入10 mL胰蛋白酶溶液，充分搖勻并使酶變性;加入10 mL BSA溶液，充分搖勻;用標定堿液小心滴定至終點，記錄滴定所用的標定堿液的體積VBSA+E。

將固定體積(10 mL)的BSA溶液與固定體積(10 mL)的胰蛋白酶溶液混合后開始計時，置于限定條件下進行酶解。酶解后，迅速轉移到已經加入0.75 mL酚酞指示劑的5 mL甲醛溶液中，充分搖勻。用標定堿液小心滴定至終點，記錄滴定所消耗的標定堿液的體積V1。此處的限定條件為10 mmol·L－1磷酸鹽緩沖液(pH7.0)、酶解溫度為37℃、酶解時間為180 min;酶解條件按參考文獻［7］的方法進行。計算酶解體系的游離氨基增量(ΔAN1)。

注意:將10 mL BSA溶液預熱后，加入10 mL胰蛋白酶溶液后迅速混合，并置于限定酶解條件下反應180 min;反應結束后，要迅速取出并進行甲醛滴定，以保證實驗體系的準確性。

1.4 蛋白質酶解度的計算

將ΔAN1和AN0代入到酶解度(DEH)的計算式［1］即可完成酶解度的計算。

式中，DEH1為第一次測量狀態下體系的酶解度，AN0為酶解反應中初始底物的肽鏈數。

2 結果與討論

2.1 游離氨基總數的甲醛滴定法測定

按1.2的操作方法分別對BSA與甘氨酸及賴氨酸溶液進行甲醛滴定，測定結果見表1。其中，氫氧化鈉溶液的標定濃度為0.009 268 mol·L－1，BSA溶液加入甲醛溶液后滴定所消耗堿液的體積標記為VFormol－BSA，BSA溶液不加甲醛溶液而直接滴定所消耗標定堿液的體積標記為VCK－BSA，相應地將甘氨酸溶液的相關結果分別標記為VFormol－Gly和VCK－Gly，賴氨酸溶液的相關結果分別標記為

VFormol－Lys和 VCK －Lys。

表1 BSA與甘氨酸及賴氨酸溶液的甲醛滴定實驗結果

2.2 甘氨酸與賴氨酸溶液修正系數的計算

根據式(1)，利用滴定結果及氫氧化鈉溶液的標定濃度(0.009 268 mol·L－1)，分別計算測定體系中的甘氨酸、賴氨酸的游離氨基總數

甘氨酸的濃度為0.01 mol·L－1，實驗中取用量為5 mL，測量體系中的甘氨酸物質的量為0.05 mmol。每個甘氨酸分子有一個游離氨基，體系中氨基的總物質的量為0.05 mmol(理論值)。而根據表1數據，實際計算出的甘氨酸溶液的游離氨基僅為0.039 85 mmol(測量值)，只占全部的79.7%。此實驗結果表明，利用甲醛滴定法測定游離氨基總數，其測定結果偏低，與文獻報導結論一致［2－4］。

根據修正系數的定義，甘氨酸溶液的游離氨基測定中的修正系數(KGly)為

在賴氨酸溶液游離氨基測定實驗中，賴氨酸的濃度為 0.01mol·L－1，取用量為 5 mL，測量體系中的賴氨酸物質的量為0.05 mmol(理論值)。根據表1數據，計算賴氨酸溶液的游離氨基測定中的修正系數(KLys)為

在上述賴氨酸溶液中，每個賴氨酸分子有一個α位游離氨基和一個ε位游離氨基，氨基總物質的量為0.1 mmol，但實際測定值僅為0.0646 mmol，只占全部的64.6%;小于甘氨酸溶液中的79.7%。這一結果表明，ε位游離氨基在甲醛作用下釋放質子的能力比α位游離氨基還要低。由于α位游離氨基和ε位游離氨基都不能在甲醛作用下完全釋放質子，所以利用甲醛滴定法測定游離氨基時，測定結果偏低，這應該是甲醛滴定法測定值偏低的主要原因。通過修正系數的引入，可以在一定程度上彌補甲醛滴定法測定結果偏低的不足。

2.3 BSA溶液中肽鏈總數的相關計算

根據 NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/CAA76847.1)信息，成熟的 BSA共583個氨基酸，利用生物信息學相關軟件可獲得BSA的計算分子量為66 451.5。根據BSA的分子量，實驗體系中將5.000 0 g溶解后定容到1 L，其最終濃度為 0.075 24 mmol·L－1;即 10 mL BSA溶液體系中肽鏈數(AN0(BSA))為 0.0 007 524 mmol(理論值)。

根據式(1)，利用表1中甲醛滴定實驗結果及氫氧化鈉溶液的標定濃度(0.009 268 mol·L－1)，計算測定體系中的BSA的游離氨基總數(ANFormol－BSA)為

從實驗結果可知，測定所用的10 mL BSA溶液中的游離氨基物質的量為0.039 48 mmol(測量值)。

根據修正系數計算式(2)，BSA溶液的修正系數(KBSA)為

對BSA的實驗測定結果和氨基酸序列進行對比分析可知，10 mL BSA溶液體系中的游離氨基測定的物質的量(0.03 948 mmol)遠大于BSA的理論物質的量(0.000 752 4 mmol)，這主要與BSA序列中存在有大量的側鏈游離氨基有關。由于BSA組成氨基酸中的側鏈氨基、胍基、酚羥基上的質子均可發生解離，都會使甲醛滴定法測定的游離氨基的數目升高。BSA序列中有59個賴氨酸、23個精氨酸、27個苯丙氨酸、17個組氨酸，這些氨基酸的側鏈基團都會影響到BSA的甲醛測定實驗結果;由于BSA有大量的側鏈解離基團，其修正系數也相應較高(KBSA為52.47)。

2.4 10 mLBSA溶液酶解后堿液消耗量的測定

按1.3 的操作方法，分別測定 V1、VBSA+E，實驗結果見表2。

表2 甲醛滴定中的堿液消耗量

2.5 利用甲醛滴定法測定BSA的酶解度

根據文獻［1］的酶解度計算式以及相關的計算式，將酶解度計算式進行整理:

從以上的計算式整理過程可以看出，只要知道了修正系數，酶解度測定只需要4個體積值，分別是:V1、VBSA+E、VFormol－BSA，VCK－BSA(見表 1)。

根據相應操作方法分別測定VBSA+E和V1，測定3次求平均值。利用ANFormol－BSA的計算結果，將10 mL BSA溶液與10 mL胰蛋白酶溶液混合后，混合液在限定酶解條件下反應180 min的酶解度DEH1，可依據式(5)進行計算:

由計算結果可知，測定體系中的BSA經過胰蛋白酶水解180 min，體系中的多肽鏈數目增加了22.7倍，即每條多肽鏈平均被切割了22.7次。如果調整酶解過程的作用溫度、作用時間、緩沖液組成，則酶解效果還可以通過酶解度進行比較，進而獲取最優化的反應條件［8］。酶解度的測定與計算結果可以與文獻［7］相配合，用于研究胰蛋白酶水解牛血清白蛋白的動力學特征;也可以參考文獻［9］的方法，研究牛血清白蛋白胰蛋白酶酶解條件與酶解產物的關系。

3 結論

(1)利用甲醛滴定實驗可以確定酶解體系中蛋白質的酶解度。

(2)利用修正系數對甲醛滴定實驗測定結果進行校正，可以提高測定結果的準確性。

(3)本文所建立的利用甲醛滴定法進行牛血清白蛋白的酶解度測定方法，不需要復雜儀器設備，便于推廣使用。在已知修正系數條件下，酶解度只與堿液消耗的4個體積有關，不需要精確標定堿液的濃度，簡化了實驗操作。

［1］劉寶全，王劍鋒，李春斌，等.蛋白質酶解度的定義［J］.大連民族學院學報，2012，14(1):9－11.

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［3］趙新淮，馮志彪.蛋白質水解物水解度的測定［J］.食品科學，1994，179(11):65 －67.

［4］徐英操，劉春紅.蛋白質水解度的測定方法綜述［J］.食品研究與開發，2007，28(7):173 －176.

［5］張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術［M］.北京:高等教育出版社，1997.

［6］徐勤，葛向陽，劉建峰.甲醛法測大豆蛋白水解度的改進［J］.飼料工業，2008，29(5):46－47.

［7］史德青，齊崴，何志敏，等.胰蛋白酶水解牛血清白蛋白過程集總動力學研究［J］.石油大學學報:自然科學版，2003，27(3):84 －87.

［8］齊崴，何志敏.基于分子機制的蛋白質酶解反應經驗修飾動力學模型［J］.分子催化，2006，20(6):585－590.

［9］王賢純，范春明，唐新科，等.牛血清白蛋白胰蛋白酶酶解產物的色譜－質譜聯用分析及其三種數據庫搜尋鑒定方法的比較［J］.中國生物化學與分子生物學報，2004，20(3):393 －398.

Determination of Degree of Enzymatic Hydrolysis of BSA by Formol Titration Method

WANG Jian－feng，SUN Shuang，LI Yao，GAI Ming－hao，XIAO Long，ZHANG Kun，LIU Bao－quan，FAN Sheng－di
(Key Laboratory of Biochemistry Engineering of the State Ethnic Affairs Commission－Ministry of Education，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China)

In this paper，the DEH(degree of enzymatic hydrolysis)of Bovine Serum Albumin(BSA)was tested and calculated with formol titration method.The conception of DEH was established and named and a determination method was developed based on formol titration.A correction coefficient was introduced to correct the determination results because of the weakness of formol titration.The values of correction coefficient of glycine and lysine in formol titration were 0.797 and 1.292，but it was 52.47 in BSA because of its abundant lateral chain groups.The α－amino group was different from ε－amino group in formol titration.According to the definition and the calculation formula of DEH，the enzymatic hydrolysis results of the BSA，which digested with trypsin in limited condition，were obtained by the formol titration method and the DEH was 22.7 in this research.

degree of enzymatic hydrolysis;formol titration method;protein;enzyme;hydrolysis

Q519

A

1009－315X(2012)05－0441－04

2011－10－27;最后

2012－04－15

教育部科學技術研究重點項目(2010－263);國家民委項目(09DL08);遼寧省教育廳資助項目(2009A154);大連民族學院人才啟動基金資助項目(20096102)。

王劍鋒(1968－)，男，遼寧錦州人，副教授，主要從事生物化學工程相關研究。

劉寶全(1972－)，男，蒙古族，遼寧北票人，副教授，博士，主要從事化學與生物學交叉學科研究，Email:lbq@dlnu.edu.cn。

(責任編輯 鄒永紅)