荔枝核提取物及其陽離子樹脂分離物體外降血糖作用

徐 婷吳 青高駿偉

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510640；2.廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東 廣州 510640）

荔枝核提取物及其陽離子樹脂分離物體外降血糖作用

徐 婷1，2吳 青1，2高駿偉1，2

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510640；2.廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東 廣州 510640）

研究荔枝核乙醇提取物（LSE）和其陽離子樹脂分離物（FCE）體外降血糖作用。采用高糖和高胰島素所致的兩種HepG2細胞模型，在模型培養中添加不同濃度的LSE與FCE，以葡萄糖試劑盒測定，MTT法等進行對HepG2細胞葡萄糖消耗作用的研究。結果表明：在高糖環境下，LSE和FCE均能促進HepG2細胞的葡萄糖消耗，而FCE的促進作用顯著高于相近濃度的LSE，提示離子交換樹脂分離物貢獻了荔枝核提取物的降糖作用；此外，FCE還可與低劑量胰島素協同增加細胞的葡萄糖消耗。在胰島素抵抗模型中，FCE能顯著降低胰島素抵抗，增加細胞的葡萄糖消耗。荔枝核提取物和其陽離子樹脂分離物具有體外降血糖作用。

荔枝核；樹脂分離；降血糖；HepG2細胞模型；胰島素抵抗模型

荔枝核是《中國藥典》收載的傳統中藥材，具有行氣散結，祛寒止痛之功能，用于寒病腹痛，睪丸腫痛［1］。而現代藥理研究［2，3］表明，荔枝核有多種功效，除有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、調血脂等作用外，還具有明顯的降血糖功效，報道的降血糖的功效成分有皂苷［4，5］、多 糖［3］、氨基酸［6］等。 但至目前，研究荔枝核降糖作用均采用的是動物模型，采用細胞模型研究還未見報道。本試驗用70%乙醇提取荔枝核，獲得乙醇提取物，再用732陽離子交換樹脂分離獲得分離物，探討它們對高糖和高胰島素所致兩種HepG2細胞模型中葡萄糖消耗作用的影響，以進一步為降糖藥物的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝核：在市場上購買品種為黑葉的新鮮荔枝，取核，清洗瀝干，50℃干燥后粉碎過40目篩，置于4℃保存備用。

HepG2細胞株：中山大學實驗動物中心細胞庫。

DMEM高糖培養基：美國Gibco公司；

胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司；

4－羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）：廣州威佳科技有限公司；

青霉素－鏈霉素雙抗：杭州吉諾生物醫藥技術有限公司；

四甲基偶氮唑鹽（MTT）、胰島素（Ins）、羅格列酮：美國Sigma公司；

二甲基亞砜、732陽離子交換樹脂：上海凌峰化學試劑有限公司；

葡萄糖測定試劑盒：北京普利萊基因技術有限公司。

1.2 儀器

電子天平：EL204－IC，瑞士 Mettler Toledo公司；

超凈工作臺：SW－CJ－2FD，蘇州凈化設備有限公司；

CO2培養箱：MDF－192，美國Shellab公司；

倒置顯微鏡：CFM－500，上海長方光學儀器有限公司；

酶標儀：Versa Max，美國 Molecular Devices公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 荔枝核乙醇提取物的制備 稱取一定量荔枝核粉于三角瓶中，按料液比1∶15（m∶V）加入70%乙醇，室溫提取2d。提取液減壓抽濾后，真空濃縮至小體積，而后加入3倍體積去離子水溶解，離心，上清液真空濃縮至干，得到荔枝乙醇提取物（litchi seed extract，LSE）。

1.3.2 陽離子交換樹脂分離物的制備 用去離子水溶解LSE，上樣于裝有經活化的732陽離子交換樹脂的玻璃柱上（2.55cm×25.6cm），用水洗脫至流出基本無色后，用0.5%氨水洗脫，流速控制在2d/s，用0.2%茚三酮溶液檢測洗脫液是否含氨基酸，自反應呈陽性起開始收集洗脫液，至反應呈陰性為止，合并陽性洗脫液，濃縮，真空干燥得荔枝核陽離子樹脂分離物（fraction by cation exchange resin，FCE）。

1.3.3 細胞培養 將HepG2細胞接種于75cm2培養瓶中，加入含10%熱滅活胎牛血清、100U/mL青霉素－鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養箱中培養。每隔2d更換1次培養液，3d后傳代，傳代數1∶4。取對數生長期的細胞進行試驗。

1.3.4 LSE和FCE對 HepG2細胞葡萄糖消耗作用及MTT毒性試驗 將LSE與FCE配制成高濃度水溶液，微濾膜過濾后，用無血清DMEM培養液稀釋至所需濃度待用。

將處于良好生長狀態的HepG2細胞，用0.25%胰蛋白酶液消化后，用含10%血清的培養液吹打成單個細胞懸液，并稀釋到需要濃度，以1×105個/mL細胞接種于96孔培養板中，置于CO2培養箱中培養，待細胞貼壁后，棄去原培養液，換無血清培養液饑餓12h后，加入含樣或不含樣的高糖DMEM培養液。將96孔培養板中細胞分為空白對照組、樣品組，每個組重復6孔，孵育24h后，用葡萄糖試劑盒（氧化酶法）測定各孔培養液中葡萄糖的濃度，采用式（1）計算葡萄糖的消耗量。

式中：

GC—— 葡萄糖的消耗量，mmol/L；

G0——0h培養液中葡萄糖濃度，mmol/L；

G24——24h培養液中葡萄糖濃度，mmol/L。

同時進行MTT毒性試驗，在葡萄糖消耗試驗孵育結束將待測培養液移出后，每孔加入150μL無血清培養液，避光加入2mg/mL MTT溶液50μL作用4h，吸棄上清液，每孔加入150μL DMSO，置于平板振蕩器上震蕩10min，使藍紫色結晶甲瓚溶解完全后，立即在酶標儀波長490nm處測定吸光值，以此反映細胞存活性與數量。

1.3.5 FCE對 HepG2細胞葡萄糖消耗的作用 按1.3.4處理細胞后，加入無血清含樣或不含樣的培養液，將細胞分為空白對照組（加和不加胰島素Ins），樣品組（加和不加Ins），羅格列酮陽性對照組（加和不加Ins），其中Ins濃度為10nmol/mL，每個處理重復6孔，于培養箱孵育24h。吸取上清培養液，用葡萄糖試劑盒測定各培養液中葡萄糖的濃度，計算葡萄糖的消耗量。

同時進行MTT毒理試驗，方法同1.3.4。

1.3.6 FCE對胰島素抵抗模型下HepG2細胞的葡萄糖消耗作用 將處于對數生長期的細胞消化后，用含10%血清的DMEM調整細胞密度為1×105，接種于96孔培養板中。待細胞貼壁后，參考Zhang等的方法［7］，加入新配制含5×10－7mol/L Ins的培養液，于CO2培養箱中培養24h，并設不含Ins的陰性空白孔。產生抵抗抑制后，培養液換為無血清的含樣或不含樣的高糖DMEM培養液。將細胞分為模型對照組、樣品組、羅格列酮陽性對照組，每個處理重復6孔，于培養箱培養24h后，吸取上清培養液，用葡萄糖試劑盒測定各培養液中葡萄糖的濃度，計算葡萄糖的消耗量。

1.4 統計學分析

數據用SPSS軟件進行統計分析，試驗結果以±s表示，各組間差異采用Duncan分析。

2 結果與分析

2.1 LSE和FCE對HepG2細胞增殖的影響

MTT毒性試驗表明，LSE在所試驗的濃度（0.14～2.44mg/mL）范圍內，對HepG2細胞的增殖沒有顯著的影響，僅在0.56mg/mL和1.22mg/mL濃度下，對 HepG2細胞的增殖產生了一定的抑制作用，細胞存活率分別為93.5%和94.3%（見圖1）。

圖1 LSE和FCE對HepG2細胞存活率的影響Figure 1 The effect of different concentrates of LSE and FCE on HepG2cell viability

FCE在所試驗的3個濃度下，同樣對細胞的存活沒有明顯的影響，僅在0.15mg/mL濃度下，對細胞的增殖產生一定的抑制作用，細胞存活率為95.2%。

2.2 LSE和FCE對HepG2細胞葡萄糖消耗的作用

由表1可知，LSE除在最低濃度0.14mg/mL下沒有增加細胞對葡萄糖的消耗作用外，其他4個濃度均表現出促進了細胞對葡萄糖的消耗，與空白對照組相比，處理組的葡萄糖消耗量顯著增加（P＜0.05），且在劑量為0.28～1.22mg/mL隨濃度的增加，呈現葡萄糖消耗量增加的趨勢；前面毒性試驗顯示，在0.56，1.22mg/mL濃度下，LSE對細胞有一定的抑制，扣除細胞增殖抑制對培養液中葡萄糖消耗的影響，用MTT校正后，LSE仍可顯著增加單位細胞的葡萄糖消耗量。

而經過732陽離子交換樹脂分離得到的氨基酸分離組分FCE則表現出更強的降糖作用，其在0.15mg/mL濃度下的活性遠遠高于0.14mg/mL LSE的活性，且隨濃度的增加，葡萄糖的消耗量增加，這提示氨基酸可能貢獻了荔枝核提取物的降糖活性。

表1 LSE和FCE對HepG2細胞葡萄糖消耗的作用ńTable 1 The effect of LSE and FCE on the glucose consumption of HepG2cell

2.3 FCE與胰島素的協同降糖作用

由表2可知，在所試驗的濃度（0.1～0.8mg/mL）范圍內，FCE可顯著增加 HepG2細胞的葡萄糖消耗量（P＜0.05），如在0.4mg/mL時，葡萄糖的攝取率可達126.4%。培養液中加入胰島素后，FCE能協同胰島素使HepG2細胞的葡萄糖消耗量增加，同樣在0.4mg/mL時，葡萄糖的攝取率達到132.9%。

從表2還可看出，與常用的降糖藥物羅格列酮相比較，在含和不含有胰島素的情況下，0.4mg/mL的FCE使細胞葡萄糖的消耗量比值分別為4.170，4.093nmol/mL，而5μg/mL羅格列酮使細胞葡萄糖的消耗量比值分別為4.052，3.947nmol/mL，說明0.4mg/mL的FCE促使細胞消耗葡萄糖的作用效果高于5μg/mL羅格列酮。

2.4 FCE對胰島素抵抗模型的HepG2細胞葡萄糖消耗的作用

HepG2細胞中有胰島素受體，在高濃度胰島素作用下會產生抵抗［8］。由圖2可知，模型對照組的葡萄糖消耗量顯著低于陰性對照組（P＜0.05），說明經過高胰島素作用后，細胞對胰島素敏感性降低，抵抗模型建立成功。

抵抗模型建立后，將FCE加入細胞中孵育，由圖2可知，各劑量下的FCE均能促進胰島素抵抗模型HepG2細胞的葡萄糖消耗，濃度為0.8mg/mL的處理組，細胞葡萄糖的消耗量為模型對照組的143.3%，這提示FCE的降糖活性可能與改善胰島素抵抗狀態有關。

表2 FCE和胰島素對HepG2細胞葡萄糖消耗的協同作用ńTable 2 The synergy effect of FCE with Insulin on the glucose consumption HepG2cells

3 結論與討論

II型糖尿病的主要特征包括胰島素抵抗，肝臟細胞、骨骼肌細胞、脂肪細胞等靶細胞對葡萄糖的攝取減少［9］，從而造成血液中葡萄糖水平升高，形成高血糖并常伴有高胰島素血癥。

肝細胞是糖代謝的主要靶細胞之一，HepG2細胞系是人肝癌細胞，具有人類肝細胞的特征，滿足典型胰島素受體所有要求，包括葡萄糖攝取、糖原合成酶的活性、脂類、蛋白質的代謝［10］。因而HepG2是研究高葡萄糖消耗模型和研究胰島素抵抗的理想模型。

圖2 FCE對高胰島素誘導抵抗模型的HepG2葡萄糖消耗作用Figure 2 The effect of FCE on the glucose consumption of insulin－resistant HepG2cell

本試驗表明，荔枝核乙醇提取物LSE能顯著促進HepG2細胞對葡萄糖的消耗，具有明顯的降糖功效。而經過732陽離子交換樹脂分離得到的分離物FCE表現出更強的降糖作用。在高糖模型中，0.4mg/mL用量下的FCE對細胞葡萄糖消耗量比對照組增加了126.4%，同時與低濃度胰島素有協同降糖作用；且隨濃度的增加，葡萄糖的消耗越多，這提示陽離子交換樹脂分離物包括氨基酸可能貢獻了荔枝核提取物的降糖活性，與文獻［6］報道荔枝核具有降血糖的作用源于所含的一種名為α－亞甲基環丙基甘氨酸的結果相符。

在進一步的胰島素抵抗模型試驗中，FCE能顯著降低抵抗作用，促進高胰島素誘發的胰島素抵抗細胞對葡萄糖的消耗，0.8mg/mL用量下的FCE對葡萄糖的消耗量為模型對照組的143.3%，說明FCE能顯著改善HepG2細胞的胰島素抵抗狀態，增加細胞對葡萄糖的攝取與利用。

本試驗應用體外細胞模型，揭示了在高糖與高胰島素環境下，荔枝核提取物和其陽離子樹脂分離物能促進肝細胞對葡萄糖的攝取，同時也具有降低細胞對胰島素的抵抗作用，進一步表明了荔枝核在糖尿病藥物開發中具有的開發價值，今后有必要深入開展其降糖活性成分的分離、純化、鑒定和降糖機理研究。

1 國家藥典委員會.中國藥典［S］.北京：化學工業出版社，2005：169.

2 鄧志軍，郭潔文，潘競鏘.荔枝和荔枝核及其有效部位的藥理及藥效學作用［J］.藥學進展，2009，19（5）：7～9，44.

3 袁紅.荔枝核多糖提取物對四氧嘧啶致糖尿病小鼠降糖作用［J］.健康研究，2010（4）：252～255.

4 姜振國，任林，徐多多，等.荔枝核降血糖有效部位的研究（一）［J］.長春中醫藥大學學報，2011，27（1）：14～16.

5 郭潔文，廖惠芳，潘競鏘，等.荔枝核皂苷對高脂血癥－脂肪肝大鼠的降血糖調血脂作用［J］.中國臨床藥理學與治療學，2004（12）：1 405～1 407.

6 Gray D O，Fowden L.α－（Methylenecyclopropyl）glycine from litchi seeds［J］.Biochem.J.，1962（82）：385～389.

7 Zhang H J，Ji B P，Chen G，et al.A combination of grape seedderived procyanidins and gypenosides alleviates insulin resistance in mice and hepG2Cells［J］.Journal of Food Science，2009，74（1）：H1～H7.

8 李長貴，寧光，陳家倫.胰島素抵抗HepG2細胞模型的建立及鑒定［J］.中國糖尿病雜志，1999，7（4）：198～200.

9 Sharma A，Kharb S，Chugh S N，et al.Evaluation of oxidative stress before and after control of glycemia and after vitamin E supplementation in diabetic patients［J］.Metabolism Clinical and Experimental，2000，49（2）：160～162.

10 張召鋒，李勇.糖尿病細胞模型的研究進展［C］//北京市營養學會第四屆會員代表大會暨膳食與健康研討會論文集.北京：中國環境誘變劑學會，2010：174～179.

Hypoglycemic effectinvitroof litchi seed extract and its fraction by cation exchange resin

XU Ting1，2WU Qing1，2GAO Jun－wei1，2

（1.College of Food Science of South China Agricultural University，Guangdong，Guangzhou510640，China；2.The Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Province，Guangdong，Guangzhou510640，China）

The hypoglycemic effects of the litchi seed extract（LSE）and fraction by cation exchange resin（FCE）were investigated.LSE or FCE with different concentration was cultured with high glucose HepG2cell model and insulin－resistant HepG2cell modelin vitro，using the method of MTT and glucose assay kit to investigate the hypoglycemic effects.The results showed that on high glucose HepG2 cell model，LSE and FCE increased the glucose consumption of HepG2cells，and FCE had higher effect compared with LSE at similar content.This revealed that fraction by cation exchange resin of litchi seed extract were attributed to the hypoglycemic effect.FCE also enhanced the glucose consumption in synergism with insulin.On insulin－resistant HepG2cell model，FCE significantly reduced the insulin resistance，increasing the glucose consumption of HepG2cells.These results suggested that LSE and FCE exhibited the hypoglycemic effectin vitro.

litchi seed；resin separation；hypoglycemic；HepG2cell model；insulin－resistant cell model

10.3969 /j.issn.1003－5788.2012.04.031

徐婷（1988－），女，華南農業大學在讀碩士研究生。E－mail：angelinetsui＠yahoo.cn

吳青

2012－02－20