荔枝核提取物及其陽(yáng)離子樹脂分離物體外降血糖作用

徐 婷吳 青高駿偉

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

荔枝核提取物及其陽(yáng)離子樹脂分離物體外降血糖作用

徐 婷1，2吳 青1，2高駿偉1，2

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

研究荔枝核乙醇提取物（LSE）和其陽(yáng)離子樹脂分離物（FCE）體外降血糖作用。采用高糖和高胰島素所致的兩種HepG2細(xì)胞模型，在模型培養(yǎng)中添加不同濃度的LSE與FCE，以葡萄糖試劑盒測(cè)定，MTT法等進(jìn)行對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗作用的研究。結(jié)果表明：在高糖環(huán)境下，LSE和FCE均能促進(jìn)HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗，而FCE的促進(jìn)作用顯著高于相近濃度的LSE，提示離子交換樹脂分離物貢獻(xiàn)了荔枝核提取物的降糖作用；此外，F(xiàn)CE還可與低劑量胰島素協(xié)同增加細(xì)胞的葡萄糖消耗。在胰島素抵抗模型中，F(xiàn)CE能顯著降低胰島素抵抗，增加細(xì)胞的葡萄糖消耗。荔枝核提取物和其陽(yáng)離子樹脂分離物具有體外降血糖作用。

荔枝核；樹脂分離；降血糖；HepG2細(xì)胞模型；胰島素抵抗模型

荔枝核是《中國(guó)藥典》收載的傳統(tǒng)中藥材，具有行氣散結(jié)，祛寒止痛之功能，用于寒病腹痛，睪丸腫痛［1］。而現(xiàn)代藥理研究［2，3］表明，荔枝核有多種功效，除有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)血脂等作用外，還具有明顯的降血糖功效，報(bào)道的降血糖的功效成分有皂苷［4，5］、多 糖［3］、氨基酸［6］等。 但至目前，研究荔枝核降糖作用均采用的是動(dòng)物模型，采用細(xì)胞模型研究還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)用70%乙醇提取荔枝核，獲得乙醇提取物，再用732陽(yáng)離子交換樹脂分離獲得分離物，探討它們對(duì)高糖和高胰島素所致兩種HepG2細(xì)胞模型中葡萄糖消耗作用的影響，以進(jìn)一步為降糖藥物的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝核：在市場(chǎng)上購(gòu)買品種為黑葉的新鮮荔枝，取核，清洗瀝干，50℃干燥后粉碎過(guò)40目篩，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HepG2細(xì)胞株：中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)。

DMEM高糖培養(yǎng)基：美國(guó)Gibco公司；

胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司；

4－羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）：廣州威佳科技有限公司；

青霉素－鏈霉素雙抗：杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；

四甲基偶氮唑鹽（MTT）、胰島素（Ins）、羅格列酮：美國(guó)Sigma公司；

二甲基亞砜、732陽(yáng)離子交換樹脂：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；

葡萄糖測(cè)定試劑盒：北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

電子天平：EL204－IC，瑞士 Mettler Toledo公司；

超凈工作臺(tái)：SW－CJ－2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

CO2培養(yǎng)箱：MDF－192，美國(guó)Shellab公司；

倒置顯微鏡：CFM－500，上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器有限公司；

酶標(biāo)儀：Versa Max，美國(guó) Molecular Devices公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 荔枝核乙醇提取物的制備 稱取一定量荔枝核粉于三角瓶中，按料液比1∶15（m∶V）加入70%乙醇，室溫提取2d。提取液減壓抽濾后，真空濃縮至小體積，而后加入3倍體積去離子水溶解，離心，上清液真空濃縮至干，得到荔枝乙醇提取物（litchi seed extract，LSE）。

1.3.2 陽(yáng)離子交換樹脂分離物的制備 用去離子水溶解LSE，上樣于裝有經(jīng)活化的732陽(yáng)離子交換樹脂的玻璃柱上（2.55cm×25.6cm），用水洗脫至流出基本無(wú)色后，用0.5%氨水洗脫，流速控制在2d/s，用0.2%茚三酮溶液檢測(cè)洗脫液是否含氨基酸，自反應(yīng)呈陽(yáng)性起開始收集洗脫液，至反應(yīng)呈陰性為止，合并陽(yáng)性洗脫液，濃縮，真空干燥得荔枝核陽(yáng)離子樹脂分離物（fraction by cation exchange resin，F(xiàn)CE）。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2細(xì)胞接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，加入含10%熱滅活胎牛血清、100U/mL青霉素－鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2d更換1次培養(yǎng)液，3d后傳代，傳代數(shù)1∶4。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.4 LSE和FCE對(duì) HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗作用及MTT毒性試驗(yàn) 將LSE與FCE配制成高濃度水溶液，微濾膜過(guò)濾后，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度待用。

將處于良好生長(zhǎng)狀態(tài)的HepG2細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶液消化后，用含10%血清的培養(yǎng)液吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，并稀釋到需要濃度，以1×105個(gè)/mL細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，換無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓12h后，加入含樣或不含樣的高糖DMEM培養(yǎng)液。將96孔培養(yǎng)板中細(xì)胞分為空白對(duì)照組、樣品組，每個(gè)組重復(fù)6孔，孵育24h后，用葡萄糖試劑盒（氧化酶法）測(cè)定各孔培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，采用式（1）計(jì)算葡萄糖的消耗量。

式中：

GC—— 葡萄糖的消耗量，mmol/L；

G0——0h培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，mmol/L；

G24——24h培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，mmol/L。

同時(shí)進(jìn)行MTT毒性試驗(yàn)，在葡萄糖消耗試驗(yàn)孵育結(jié)束將待測(cè)培養(yǎng)液移出后，每孔加入150μL無(wú)血清培養(yǎng)液，避光加入2mg/mL MTT溶液50μL作用4h，吸棄上清液，每孔加入150μL DMSO，置于平板振蕩器上震蕩10min，使藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚溶解完全后，立即在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光值，以此反映細(xì)胞存活性與數(shù)量。

1.3.5 FCE對(duì) HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的作用 按1.3.4處理細(xì)胞后，加入無(wú)血清含樣或不含樣的培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（加和不加胰島素Ins），樣品組（加和不加Ins），羅格列酮陽(yáng)性對(duì)照組（加和不加Ins），其中Ins濃度為10nmol/mL，每個(gè)處理重復(fù)6孔，于培養(yǎng)箱孵育24h。吸取上清培養(yǎng)液，用葡萄糖試劑盒測(cè)定各培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，計(jì)算葡萄糖的消耗量。

同時(shí)進(jìn)行MTT毒理試驗(yàn)，方法同1.3.4。

1.3.6 FCE對(duì)胰島素抵抗模型下HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗作用 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后，用含10%血清的DMEM調(diào)整細(xì)胞密度為1×105，接種于96孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后，參考Zhang等的方法［7］，加入新配制含5×10－7mol/L Ins的培養(yǎng)液，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，并設(shè)不含Ins的陰性空白孔。產(chǎn)生抵抗抑制后，培養(yǎng)液換為無(wú)血清的含樣或不含樣的高糖DMEM培養(yǎng)液。將細(xì)胞分為模型對(duì)照組、樣品組、羅格列酮陽(yáng)性對(duì)照組，每個(gè)處理重復(fù)6孔，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，吸取上清培養(yǎng)液，用葡萄糖試劑盒測(cè)定各培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，計(jì)算葡萄糖的消耗量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果以±s表示，各組間差異采用Duncan分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LSE和FCE對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

MTT毒性試驗(yàn)表明，LSE在所試驗(yàn)的濃度（0.14～2.44mg/mL）范圍內(nèi)，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖沒(méi)有顯著的影響，僅在0.56mg/mL和1.22mg/mL濃度下，對(duì) HepG2細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了一定的抑制作用，細(xì)胞存活率分別為93.5%和94.3%（見(jiàn)圖1）。

圖1 LSE和FCE對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Figure 1 The effect of different concentrates of LSE and FCE on HepG2cell viability

FCE在所試驗(yàn)的3個(gè)濃度下，同樣對(duì)細(xì)胞的存活沒(méi)有明顯的影響，僅在0.15mg/mL濃度下，對(duì)細(xì)胞的增殖產(chǎn)生一定的抑制作用，細(xì)胞存活率為95.2%。

2.2 LSE和FCE對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的作用

由表1可知，LSE除在最低濃度0.14mg/mL下沒(méi)有增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗作用外，其他4個(gè)濃度均表現(xiàn)出促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗，與空白對(duì)照組相比，處理組的葡萄糖消耗量顯著增加（P＜0.05），且在劑量為0.28～1.22mg/mL隨濃度的增加，呈現(xiàn)葡萄糖消耗量增加的趨勢(shì)；前面毒性試驗(yàn)顯示，在0.56，1.22mg/mL濃度下，LSE對(duì)細(xì)胞有一定的抑制，扣除細(xì)胞增殖抑制對(duì)培養(yǎng)液中葡萄糖消耗的影響，用MTT校正后，LSE仍可顯著增加單位細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

而經(jīng)過(guò)732陽(yáng)離子交換樹脂分離得到的氨基酸分離組分FCE則表現(xiàn)出更強(qiáng)的降糖作用，其在0.15mg/mL濃度下的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于0.14mg/mL LSE的活性，且隨濃度的增加，葡萄糖的消耗量增加，這提示氨基酸可能貢獻(xiàn)了荔枝核提取物的降糖活性。

表1 LSE和FCE對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的作用ńTable 1 The effect of LSE and FCE on the glucose consumption of HepG2cell

2.3 FCE與胰島素的協(xié)同降糖作用

由表2可知，在所試驗(yàn)的濃度（0.1～0.8mg/mL）范圍內(nèi)，F(xiàn)CE可顯著增加 HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗量（P＜0.05），如在0.4mg/mL時(shí)，葡萄糖的攝取率可達(dá)126.4%。培養(yǎng)液中加入胰島素后，F(xiàn)CE能協(xié)同胰島素使HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗量增加，同樣在0.4mg/mL時(shí)，葡萄糖的攝取率達(dá)到132.9%。

從表2還可看出，與常用的降糖藥物羅格列酮相比較，在含和不含有胰島素的情況下，0.4mg/mL的FCE使細(xì)胞葡萄糖的消耗量比值分別為4.170，4.093nmol/mL，而5μg/mL羅格列酮使細(xì)胞葡萄糖的消耗量比值分別為4.052，3.947nmol/mL，說(shuō)明0.4mg/mL的FCE促使細(xì)胞消耗葡萄糖的作用效果高于5μg/mL羅格列酮。

2.4 FCE對(duì)胰島素抵抗模型的HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的作用

HepG2細(xì)胞中有胰島素受體，在高濃度胰島素作用下會(huì)產(chǎn)生抵抗［8］。由圖2可知，模型對(duì)照組的葡萄糖消耗量顯著低于陰性對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明經(jīng)過(guò)高胰島素作用后，細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低，抵抗模型建立成功。

抵抗模型建立后，將FCE加入細(xì)胞中孵育，由圖2可知，各劑量下的FCE均能促進(jìn)胰島素抵抗模型HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗，濃度為0.8mg/mL的處理組，細(xì)胞葡萄糖的消耗量為模型對(duì)照組的143.3%，這提示FCE的降糖活性可能與改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)有關(guān)。

表2 FCE和胰島素對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的協(xié)同作用ńTable 2 The synergy effect of FCE with Insulin on the glucose consumption HepG2cells

3 結(jié)論與討論

II型糖尿病的主要特征包括胰島素抵抗，肝臟細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等靶細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取減少［9］，從而造成血液中葡萄糖水平升高，形成高血糖并常伴有高胰島素血癥。

肝細(xì)胞是糖代謝的主要靶細(xì)胞之一，HepG2細(xì)胞系是人肝癌細(xì)胞，具有人類肝細(xì)胞的特征，滿足典型胰島素受體所有要求，包括葡萄糖攝取、糖原合成酶的活性、脂類、蛋白質(zhì)的代謝［10］。因而HepG2是研究高葡萄糖消耗模型和研究胰島素抵抗的理想模型。

圖2 FCE對(duì)高胰島素誘導(dǎo)抵抗模型的HepG2葡萄糖消耗作用Figure 2 The effect of FCE on the glucose consumption of insulin－resistant HepG2cell

本試驗(yàn)表明，荔枝核乙醇提取物L(fēng)SE能顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗，具有明顯的降糖功效。而經(jīng)過(guò)732陽(yáng)離子交換樹脂分離得到的分離物FCE表現(xiàn)出更強(qiáng)的降糖作用。在高糖模型中，0.4mg/mL用量下的FCE對(duì)細(xì)胞葡萄糖消耗量比對(duì)照組增加了126.4%，同時(shí)與低濃度胰島素有協(xié)同降糖作用；且隨濃度的增加，葡萄糖的消耗越多，這提示陽(yáng)離子交換樹脂分離物包括氨基酸可能貢獻(xiàn)了荔枝核提取物的降糖活性，與文獻(xiàn)［6］報(bào)道荔枝核具有降血糖的作用源于所含的一種名為α－亞甲基環(huán)丙基甘氨酸的結(jié)果相符。

在進(jìn)一步的胰島素抵抗模型試驗(yàn)中，F(xiàn)CE能顯著降低抵抗作用，促進(jìn)高胰島素誘發(fā)的胰島素抵抗細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗，0.8mg/mL用量下的FCE對(duì)葡萄糖的消耗量為模型對(duì)照組的143.3%，說(shuō)明FCE能顯著改善HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取與利用。

本試驗(yàn)應(yīng)用體外細(xì)胞模型，揭示了在高糖與高胰島素環(huán)境下，荔枝核提取物和其陽(yáng)離子樹脂分離物能促進(jìn)肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，同時(shí)也具有降低細(xì)胞對(duì)胰島素的抵抗作用，進(jìn)一步表明了荔枝核在糖尿病藥物開發(fā)中具有的開發(fā)價(jià)值，今后有必要深入開展其降糖活性成分的分離、純化、鑒定和降糖機(jī)理研究。

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2 鄧志軍，郭潔文，潘競(jìng)鏘.荔枝和荔枝核及其有效部位的藥理及藥效學(xué)作用［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2009，19（5）：7～9，44.

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9 Sharma A，Kharb S，Chugh S N，et al.Evaluation of oxidative stress before and after control of glycemia and after vitamin E supplementation in diabetic patients［J］.Metabolism Clinical and Experimental，2000，49（2）：160～162.

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Hypoglycemic effectinvitroof litchi seed extract and its fraction by cation exchange resin

XU Ting1，2WU Qing1，2GAO Jun－wei1，2

（1.College of Food Science of South China Agricultural University，Guangdong，Guangzhou510640，China；2.The Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Province，Guangdong，Guangzhou510640，China）

The hypoglycemic effects of the litchi seed extract（LSE）and fraction by cation exchange resin（FCE）were investigated.LSE or FCE with different concentration was cultured with high glucose HepG2cell model and insulin－resistant HepG2cell modelin vitro，using the method of MTT and glucose assay kit to investigate the hypoglycemic effects.The results showed that on high glucose HepG2 cell model，LSE and FCE increased the glucose consumption of HepG2cells，and FCE had higher effect compared with LSE at similar content.This revealed that fraction by cation exchange resin of litchi seed extract were attributed to the hypoglycemic effect.FCE also enhanced the glucose consumption in synergism with insulin.On insulin－resistant HepG2cell model，F(xiàn)CE significantly reduced the insulin resistance，increasing the glucose consumption of HepG2cells.These results suggested that LSE and FCE exhibited the hypoglycemic effectin vitro.

litchi seed；resin separation；hypoglycemic；HepG2cell model；insulin－resistant cell model

10.3969 /j.issn.1003－5788.2012.04.031

徐婷（1988－），女，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：angelinetsui＠yahoo.cn

吳青

2012－02－20