關于大豆異黃酮檢測方法的探討

張爽

（陜西國際商貿學院醫藥分院，陜西 咸陽 712046）

大豆異黃酮主要存在于豆科蝶形花亞科植物中，是大豆生長中形成的一類次級代謝產物。其主要成分是：大豆甙，大豆甙元，染料木甙，染料木素，黃豆黃素，黃豆黃素甙元。由于它是從植物中提取，有著與雌激素相似的結構，因此大豆異黃酮又稱植物雌激素。可防治一些和雌激素水平下降有關的疾病，如：延緩女性衰老、改善更年期癥狀、預防骨質疏松等疾病，同時可提高機體免疫力，抗氧化、抗溶血等。目前，大豆異黃酮的檢測方法有：利用紫外吸收特征檢測、色譜原理檢測、醫學熒光免疫法檢測。

1 利用紫外吸收特征檢測

1.1 紫外分光光度法

大豆異黃酮結構中的羥基和芳香環形成較強的共軛體系對波長在250～260nm的紫外光有較強的特征吸收峰，且它的各組分最大吸收波長相差不大，峰數目較少。可采用紫外分光光度法對大豆異黃酮進行含量測定。該法簡便，重現性好，準確性及靈敏度較高，使用的試劑毒性小、廉價易得。黃莉等[1]以染料木素為標準品，在紫外最大吸收峰260nm處，用紫外分光光度法測定大豆豆粕中異黃酮的含量。回歸方程A=0.1676X-0.0118r=0.9982，平均回收率為99.84%，相對標準偏差為1.03%。

1.2 三波長法

三波長吸光光度法根據大豆異黃酮在240nm、260nm、280nm三個波長處吸光值，分別計算△A，計算方法為：△A=A260一(A240+A280)／2。△A 與待測物濃度成正比，進而求得待測物質濃度。在提取大豆異黃酮時，多用乙醇為溶劑，色素及醇溶性蛋白等也被提取出來。若用單波長法測定，背景會產生較大吸收，降低了測定的準確度。三波長法可以有效地消除這些干擾，并且方法簡便，靈敏，省時，重現性好，所用儀器便宜。鞠興榮等[2]采用三波長紫外分光光度法測定大豆異黃酮含量，有效地消除了隨濃度不同發生的本底漂移、油脂等干擾物質及吸收峰不對稱給定量分析造成的影響。最低檢出濃度為1μg/ml，加樣回收率99%，具有良好的準確性和精密度。

2 利用色譜的原理檢測

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法是目前檢測大豆異黃酮應用最廣泛的一種方法。所用色譜柱一般以小粒徑填料填充，其柱效高、分離效果好。同時，柱后可接多種高靈敏度檢測器，對流出物可進行連續檢測。此法具有成本低、樣品制備步驟少、準確性高、儀器自動化程度高等優點。張磊等[3]采用HPLC法，Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相:甲醇 20.3%磷酸溶液(體積比 48∶52)，流速 0.7mL/min，測定波長260nm，柱溫25℃。結果制備的大豆異黃酮苷元總含量為70.98%;大豆苷元、黃豆黃素和染料木素平均回收率分別為98.7%、98.9%和99.2%，RSD分別為2.1%、1.6%和1.4%。

2.2 高效液相色譜～質譜法

高效液相色譜一質譜法在測定大豆異黃酮含量時只需3種黃酮糖苷標樣就可以對其進行定量分析，解決了單純用高效液相色譜法時標樣缺乏的難題，且該法能迅速準確的確定檢測大豆異黃酮液相色譜圖中各色譜峰歸屬。是一種先進、高效、快捷的分析技術。以大豆胚芽、大豆粕等原料用60%乙醇提取，高效液相色譜法分析大豆中8種異黃酮成分，并根據色譜峰的質譜特征，鑒定出各種異黃酮。采用 Novapak C18 柱 (Φ3.9×150mm，4μm)，流動相為 A-0.1%乙酸/水、B-0.1%乙酸/乙腈，梯度洗脫，柱溫40℃，檢測波長為254nm，外標法定量，檢測時間23min。測定4種異黃酮的相對標準偏差 (RSD)為0.5%～1.2%，回收率99.01%～103.0%。

2.3 毛細管電泳法

毛細管電泳法是以高壓電場為驅動力，毛細管為分離通道，依據樣品中各組分之間淌度和分配行為上差異而實現分離技術。該法準確、可靠、經濟、操作簡便。目前，已逐漸成為測定植物雌激素的常規方法之一。葉靜等[5]測定豆粕及發酵豆粕中大豆異黃酮含量。方法:采用膠束毛細管電泳法，未涂層彈性石英毛細管(50μm×60cm，50cm);壓力進樣，壓力:3.0×103Pa;進樣時間:5s;分離電壓:17kV;柱溫:20℃;檢測波長:254nm;運行緩沖液:15mmol.L-1十二烷基硫酸鈉、5%甲醇的10mmol.L-1硼砂溶液(pH9.4)。結果:測得6種大豆異黃酮組分在24min內能完全分離并具有良好的線性關系;平均加樣回收率(n=5)在99.6%～103.5%之間，RSD為1.8%～2.3%。

2.4 薄層掃描色譜法

薄層掃描色譜法利用各成分對同一吸附劑吸附能力不同，當移動相流過固定相時，連續產生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，來達到分離各成分的目的。此法適用于揮發性較小或較高溫度易變化且不能用氣相色譜分析的物質。該法有靈敏度及分辨率高、分離快速、操作方便、樣品預處理簡單、設備簡單等優點。但其薄層顯色劑用量難以準確控制，人為誤差較大。徐穎等[6]采用聚酰胺薄層色譜法分離鑒定異黃酮，以乙醇-水-甲酸(4∶1∶0.1)為展開劑，染料木甙的Rf值0.70、大豆甙元的Rf值為0.51、染料木素的Rf值為0.43。

2.5 雙向紙層析色譜法

雙向紙層析法適用于分離鑒定復雜的混合物。方法：以濾紙做載體，利用第一種層析系統進行第一向層析后，將濾紙烘干，濾紙旋轉90°，用另一層析系統進行第二向層析。該法有著重現性好、特異性高、操作簡單、設備要求不高的特點。在沒有高效液相色譜儀的情況下，要了解異黃酮提取工藝中每一個流程異黃酮的變化雙向紙層析色譜法是較為理想的方法。彭義交等[7]采用雙相紙層析方法對大豆異黃酮進行分離，其結果與液-質色譜法基本吻合。

其它還有氣相色譜法和氣相色譜－質譜法。氣相色譜法具有準確度高、重現性好、靈敏度及特異性高等優點，但此法操作較繁瑣、耗時長、設備昂貴。因此，限制了該法推廣。氣相色譜－質譜法，靈敏度高，定性能力更準確，可用于食品中大豆苷元和染料木素常規分析的方法。這兩種方法國外學者應用的比較多。四標樣快速測定法以其準確、快速、簡單的特點，滿足工業生產過程中檢測的需要。

3 醫學上熒光免疫法

主要包括時間分辨熒光免疫分析法、酶聯免疫吸附法。這兩種方法重現性好、特異性高、靈敏、結果判斷客觀準確、實用性強。目前已廣泛在臨床醫學中用于研究血漿、尿液及糞便中大豆異黃酮體檢測。

[1] 黃莉等.紫外分光光度法測定豆粕中大豆異黃酮的含量[J].科技信息，2010年26期.

[2] 鞠興榮等.三波長紫外分光光度法測定大豆異黃酮的研究[J].食品科學，2001年5期.

[3] 張磊等.大豆異黃酮苷元檢測方法的研究[J].廣東藥學院學報，2008年2月第24卷.

[4] 龔凌霄等.高效液相色譜-質譜法快速測定大豆異黃酮含量[J].中國油脂，2006年2期.

[5] 葉靜等.膠束毛細管電泳測定豆粕及發酵豆粕中大豆異黃酮含量[J].中國藥學雜，2010年3期.

[6] 徐穎等.聚酰胺薄層色譜法分離鑒定異黃酮[J].中國糧油學報，2005年第5期.

[7] 彭義交等.大豆異黃酮雙向紙層析分析方法的研究[J].食品科學，2004年第4期.