Cyt－C Bcl－XL和Bcl－XS在大鼠創傷性腦損傷模型中的表達意義

宋 宇 魏志玄（通訊作者）

南陽醫專第一附屬醫院神經外科 南陽 473000

Cyt C、Bcl－XL和Bcl－XS在外傷性會出現神經元中表達變化，在不同模型中，由于存在許多影響因素，表達變化的規律也不盡相同。受傷后，腦的不同部位神經元Cyt C、Bcl－XL和Bcl－XS表達隨損傷后不同時間亦呈現一定的變化規律［1］。本文對創傷性腦損傷后海馬CA2、CA3區Cyt－C表達與Bcl－XL和Bcl－XS表達進行研究，揭示腦損傷后不同時間其變化規律，為腦創傷臨床研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑：甲苯胺藍（南陽醫專一附院病理中心實驗室提供）、Bcl－XL和Bcl－XS原位雜交檢測試劑盒 （武漢博士德生物生物工程有限公司）、細胞色素C檢測試劑盒（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶免疫組化染色試劑盒（SP）（天津灝洋生物制品科技有限公司）、多聚賴氨酸（天津灝洋生物制品科技有限公司）、DAB顯色液（天津灝洋生物制品科技有限公司）

1.1.2 主要儀器設備：DH－140型動物人工呼吸機（浙江醫科大學醫學儀器實驗廠）、改良Feeney自由落體打擊裝置、Olympus光學顯微鏡（日本）、Motic病理圖像分析系統：（北京航空航天大學）、HH－s恒溫水浴箱（金壇市醫療儀器廠）、隔水式電熱恒溫箱（湖北省黃石市醫療儀器廠）、PIKA切片機（日本）、免疫組化濕盒、染色缸、微量移液器。

1.2 實驗動物 健康雄性SD大鼠60只，體質量300～350 g，采取自然光照，自由進食喂養，喂養1周后制作顱腦損傷動物模型。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組 實驗動物隨機分成2h、6h、12h、24 h、72h、120h、168h9個時相組和正常組，每組5只大鼠。

2.2 大鼠腦挫裂傷模型處理方法 按照改良Feeney自由落體腦損傷模型方式制作大鼠左頂葉腦挫裂傷模型。損傷裝置由底板、固定支架、垂直導引桿、下落擊錘和撞擊圓錐組成。導桿84.3g，擊錘23.1g，撞擊圓錐頭端直徑4mm，高2.5mm。以10%水合氯醛按照350mg／kg腹腔內注射麻醉大鼠后，將其頭部固定，剪去頂部皮毛，消毒皮膚后，沿中線左側矢狀切開頭皮，剝離骨膜顯露左頂顱骨，于中線左側旁開約2mm，前囟后約2mm處用牙科鉆開一直徑5mm圓形骨窗，保持硬膜完整。以40g砝碼于25cm高處通過金屬導桿落下，撞擊置于硬腦膜上的圓錐致重型腦挫裂傷，用骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，置鼠籠喂養。實驗過程中用維持大鼠肛溫36.5～37.5℃，直至蘇醒。

2.3 標本采集及制備 各時相點在10%水合氯醛深度麻醉狀態下開胸，穿刺左心室，經心用1%肝素生理鹽水，直至回流液清亮，再緩慢灌注4%多聚甲醛溶液，大鼠開始出現全身肌肉抽動、四肢僵直表明灌注成功。斷頭并取腦組織標本，置于10%中性甲醛于后固定24h。取出固定液中的腦組織標本，冠狀位切取前囟后3.3～4.3mm腦組織，常規脫水、透明、石蠟包埋。冠狀面連續切片，厚度約5μm，以經粘片劑處理過的載玻片撈片，晾干后置于60℃烤箱烘烤4h。Cyt－C免疫組化檢測法（SP法）和Bcl－XL和Bcl－XS原位雜交檢測參考Jiang等［2］的方法。

2.4 計數方法 本實驗所采用的打擊方案中，受力的中心部位在大鼠海馬CA2－CA3區（包括CA2與CA3交界部），故該區變化最為明顯。所以我們選取此部位進行觀察，在Motic病理圖象分析系統下，隨機計數大鼠海馬CA2－CA3區0.01mm2中細胞色素C陽性細胞數及凋亡細胞數并測量細胞色素C陽性細胞積分光密度值、凋亡細胞平均灰度值，以此間接反映其相對含量。

2.5 統計學方法 實驗中所得數據以Excel數據庫整理后用SPSS 11.0統計軟件包進行t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 Cyt－C免疫組化結果 Cyt－C免疫組化顯示，大鼠腦挫裂傷后2h海馬CA2－CA3區已出現Cyt－C陽性神經元的表達，顯微鏡下陽性細胞胞漿著棕黃色，傷后2hCyt－C陽性神經元的數量逐漸增加，6h達到高峰，傷后12hCyt－C陽性神經元的數量明顯下降，到傷后24、48、72、120、168hCyt－C的表達基本消失。Cyt－C陽性細胞主要位于海馬CA2－CA3區及齒狀回，正常組海馬區幾乎未見Cyt－C表達陽性神經元（P＜0.05）。

圖1 創傷后Cyt－C陽性神經元的變化趨勢

3.2 Bcl－XL和 Bcl－XS原位雜交結果 Bcl－XL和 Bcl－XS原位雜交結果顯示，大鼠腦挫裂傷后2h海馬CA2－CA3區Bcl－XL已開始減少，傷后24h下降明顯，48h已逐漸平穩；Bcl－XS于傷后24h開始增加，到傷后72h達峰值；Bcl－XL和Bcl－XS的比值隨手損傷的時間的延長而逐漸下降，各個時點的比值均＜1（P＜0.05）。

圖2 創傷后Bcl－XL和Bcl－XS的比值變化趨勢

4 討論

Bcl－2基因家族在細胞凋亡中起調節作用，它包括兩個基因，一個抑制細胞凋亡如 Bcl－2、Bcl－XL、Bcl－W，另一個促進細胞凋亡如 Bax、Bak、Bcl－XS［3］。Bcl－2 抑制caspase－9的激活是通過阻止Cyt－C由線粒體釋放，防止Cyt－C與Apaf－1結合而實現。Cyt－C是電子傳遞鏈的重要組分它通過與胞漿因子 Apaf－1及caspase－9等結合成“凋亡誘導復合物”使caspase－9自催化激活，進而激活caspase－3等而促進細胞凋亡。Cyt－C由線粒體向細胞質釋放是caspase－3激活的必要條件，caspase－3是caspase家族最重要的凋亡執行者，凋亡執行階段負責對全部或部分關鍵性蛋白的酶切。Bcl－XL與Bcl－XS調節細胞的凋亡，不僅取決于自身表達的高低，還與Bcl－XL與 Bcl－XS比值有關。Bcl－XL與 Bcl－XS比值決定細胞對各種引起凋亡刺激的敏感性，當比值增大時，細胞趨于凋亡［4］。

細胞色素C（Cytochrome C，Cyt－C）是一個定位于線粒體膜間隙的相對分子質量為15kD的水溶性蛋白質，是在呼吸鏈中電子傳遞必需的一類色素蛋白，其色素輔基是含鐵的卟啉衍生物。正常情況下Cyt－C電穩定性地結合于線粒體內膜，不能通過外膜。Cyt－C缺乏時，電子傳遞鏈被阻斷，將導致兩方面的后果：ATP合成減少及不完全氧化造成的超氧陰離子（ROS）過度生成，而ROS是誘導凋亡的重要因素。在凋亡過程中起重要作用的不只是線粒體呼吸活性的喪失，更重要的是線粒體內外膜間的Cyt－C移位至胞質，在ATP／dATP的參與下，與 Apaf－1（apoptotic protease activating factors）結合形成寡聚體（apoptosome），在 Apaf－1介導下，Cyt－C首先使procaspase－9裂解產生活化的caspase－9，活化的caspase－9再使procaspase－3裂解產生活化的caspase－3，活化的caspase－3使具有DEVD序列的聚（腺苷二磷酸核糖）聚合酶（PARP）前體裂解產生有活性的PARP后者在細胞凋亡的后續事件中起重要。caspase－3是caspase家族最重要的凋亡執行者之一，在凋亡的執行階段，負責對全部或部分關鍵性蛋白的酶切作用（激活或滅活）。Cyt－C自線粒體的釋放在激活caspase、誘導細胞凋亡方面具有重要意義。Sulliven等［5］用Western Blot法研究腦損傷后神經元Cyt－C的釋放情況，發現傷后神經元胞漿中Cyt－C釋放具有明顯的時相性，而線粒體中Cyt－C的含量則隨時間變化而不斷下降。

雖然大量的臨床和動物實驗都證明了創傷性腦損傷后神經細胞凋亡的出現，但是關于腦損傷后神經細胞凋亡的確切機制尚未完全明確。本課題按照改良Feeney自由落體腦損傷模型方式制作左頂葉重型腦挫裂傷模型，通過采用免疫組化對大鼠腦挫裂傷后Cyt－C釋放、神經細胞凋亡情況進行檢測，結果顯示，在直接損傷部位存在著神經元細胞的壞死，但在損傷周圍區域及海馬CA2－CA3區則發現了Cyt－C陽性神經元的釋放，而且Cyt－C釋放、凋亡具有明顯的時相性。腦損傷后1h海馬CA2－CA3區即出現Cyt－C陽性染色的神經細胞，Cyt－C主要表達于神經元胞漿內，于6h達高峰，12h后開始減少，這與相關文獻報道大致相同。腦挫裂傷早期，海馬CA2－CA3區出現Cyt－C陽性染色的神經細胞，Cyt－C主要表達于神經元胞漿內，可能是創傷后線粒體結構被破壞，電子傳遞鏈被阻斷，線粒體膜通透性的改變，導致呼吸鏈與氧化磷酸化失偶聯，ATP合成減少，線粒體基質Ca2＋外流，還原性谷胱甘肽和NAD（P）H2減少，不完全氧化造成的超氧陰離子增加。有報道認為創傷性腦損傷后Cyt－C的釋放部分是氧自由基依賴性的。一方面線粒體的損傷導致了這些物質的釋放，另一方面這些物質的釋放又加重了線粒體的損傷，這樣使得定位于線粒體內膜的Cyt－C釋放入胞漿，Cyt－C自線粒體的釋放激活了caspase，活化的caspase自身也可以刺激線粒體釋放Cyt－C，有研究發現活化的部分caspase與分離出的線粒體作用，能改變線粒體膜的通透性，導致內膜跨膜電位的喪失。這樣就有可能存在一個caspase和線粒體自身反饋的環。大量氧自由基的形成加重了線粒體的損傷，如此反復，也形成一個自身反饋的環。以往和目前的研究［6］表明，腦外傷后給予氧自由基清除劑能明顯減輕損傷，據此認為胞漿內的氧自由基可能通過開放膜通透轉運孔或者損害線粒體膜的完整性，導致了Cyt－C的釋放。腦挫裂傷中期，線粒體破壞嚴重，Cyt－C釋放達高峰，Cyt－C可作為腦損傷早期診斷和損傷時間推斷提供一項輔助診斷依據。

［1］Busto R.Small difference in intraischemic brain temperature critically determine the extent of ischemic neuronal injury［J］.Cereb Blood Flow Metab，1987，7（6）：729－738.

［2］Jiang JY，Lyeth BG，Clifton GL，et al.Relationship between body and brain temperature in traumatically brain－injured rodents［J］.Neurosurgery，1991，74（3）：492－496.

［3］Xu L，Yenari MA，Steinberg GK.Mild hypothermia reduces apoptosis of mouseneurons in vitro early in the cascade［J］.Cereb Blood Flow Metab，2002，22（1）：21－28.

［4］Edwards AD，Yue X，Squire MV，et al.Specific inhibition of apoptosis after cerebral hypoxia－ischemia by moderate post－insult hypothermia［J］.Biochem Biophys Res Commun，1995，217（3）：1 193－1 199.

［5］Sullivan PG，Keller JN，Bussen WL，et al.Cytochrome Crelease and caspase activation after traumatic brain injury［J］.Brain Research，2002，949（1－2）：88－96.

［6］Luetjens CM，Bui NT，Sengpie LB.Delayed mitochondrial dysfunction in excitotoxic neuron death：Cytochrome C release and a secondary increase in superoxide production［J］.Neuroscience，2000，20（15）：5 715.