沉默miR-146a對認知功能障礙大鼠干預效果及作用機制

劉嬋媛 付遠兵 趙金慧 陳漢華

(武漢科技大學附屬武漢市武昌醫院精神心理科，湖北 武漢 430070)

認知功能障礙主要表現為記憶功能障礙，多發于老年群體〔1，2〕。由于我國人口老齡化問題日趨嚴重，導致近年來該認知障礙病例連年上升，引起社會的廣泛關注〔3，4〕。發生老年癡呆的患者均存在認知功能障礙，有學者表示，早發現認知功能障礙，并進行積極防治，對老年癡呆預防具有重要意義〔5〕。因此本文主要研究認知功能障礙發生機制，探究新的治療方式及針對認知功能障礙存在的治療意義。本研究通過建立認知功能障礙大鼠模型，靶向調控miR-146a表達，觀察這種方式的作用。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只SD健康雄性大鼠，由江蘇科惟生物技術有限公司提供，7～10月齡，平均(8.5±1.2)個月；體重215～244 g，平均(229.5±11.6)g。在相對濕度45%～55%、溫度(26.5±4.4)℃的環境中喂養大鼠，每天接受12 h太陽照射，培養1 w。本研究經醫院倫理委員會批準。主要試劑：兔抗小鼠白細胞介素(IL)-1β、IL-6抗體(美國Hyclone公司)；大鼠抗小鼠S100β抗體(Gibco公司)；兔抗大鼠miR-146a抗體(美國Becton)；小鼠抗大鼠神經元特異性烯醇化酶(NSE)、胞源性神經營養因子(BDNF)抗體(美國 Sigma公司)；小鼠抗兔腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(美國 Invitrogen公司)；大鼠抗小鼠B細胞淋巴瘤(Bcl-2)抗體(美國 Selleck Chemicals公司)；小鼠抗兔半胱氨酸蛋白酶(caspase)3抗體(丹麥 Dako公司)。

1.2方法

1.2.1建模及分組 隨機從40只大鼠中抽出10只為正常組，另外30只建立認知功能障礙模型：參照劉玥欣等〔6〕研究中建模方法，對大鼠進行麻醉干預后固定，頸部去毛后對表皮進行消毒處理，縱向切開皮膚，將左側頸總動脈、筋膜以及肌肉組織分離，對左側頸總動脈進行結扎，局部注射青霉素預防感染，將切口縫合。將30只認知功能障礙大鼠隨機分為模型組、過表達miR-146a組、沉默miR-146a組各10只，過表達miR-146a組尾部靜脈注射25 mg/kg agomiR-146a，沉默miR-146a組尾部靜脈注射25 mg/kg antagomiR-146a，正常組、模型組大鼠尾部靜脈注射等量生理鹽水。

1.2.2學習記憶能力檢測 準備一個高60 cm、直徑為160 cm的水池，將水池一半注入溫度為21℃的水，并在水池中設置4個入水點。在水池中央設置平臺，將所有大鼠從入水點放入水中，對各組由入水點游至平臺的時間進行記錄，若2 min還沒到達平臺，采用主動引到平臺的方式，潛伏期計為2 min。大鼠在平臺上停留一會后，再將其從其他不同入水點再次放入，進行連續測試，所有大鼠連續測試4 d，第5天撤除水池中央平臺，將大鼠自入水點放入水中，記錄1 min內大鼠穿越平臺次數。

1.2.3標本制備 取各組大鼠尾部靜脈血5 ml，3 000 r/min離心處理10 min后，使上清液分離，在-70℃環境中保存待檢。麻醉處理各組，將大鼠斷頭處死，取其海馬區腦組織，浸泡于5%甲醛中，24 h后進行石蠟包埋及連續切片處理。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色 將切片標本進行烤干、脫蠟處理。使用蘇木素染色20 min后清洗3～4次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗后使用3%伊紅染色，再次使用酒精對切片進行脫水、脫蠟處理，對其切片進行封片后，用顯微鏡觀察。

1.2.5S100β、NSE、BDNF、TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測 酶聯免疫吸附試驗檢測標本S100β、NSE、BDNF、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。操作按試劑盒說明書進行。

1.2.6miR-146a表達檢測反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測miR-146a表達。提取細胞總RNA，檢測RNA純度、含量，逆轉錄處理后獲得互補DNA(cDNA)，設計引物序列，采用2-ΔΔCt方法計算miR-146a表達。

1.2.7Bcl-2、caspase3相對表達量檢測 Western印跡檢測Bcl-2、caspase3表達：取160℃放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液，6℃苯甲基磺酰氟(PMSF)冰中孵育30 min，4℃ 2 000 r/min離心15 min，取上清。每個樣品取20 g蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉入聚偏氟乙烯(PDVF)膜，7%脫脂牛奶常溫下密封2 h。加入抗體過夜。取出后使用TBST液沖洗，結合第二抗體，1 h后清洗、顯色，從而檢測Bcl-2、caspase3相對表達量。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行F檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1各組腦組織病理學觀察 與正常組比較，模型組、過表達miR-146a組腦組織細胞排列不規則，并且附有嚴重的腫脹、破裂狀況；沉默miR-146a組大鼠腦組織細胞腫脹、破裂狀況情況相對過表達miR-146a組較輕，且細胞排列較規則，見圖1。

圖1 各組腦組織病理學觀察(HE染色，×400)

2.2各組學習記憶能力比較 過表達miR-146a組、模型組、沉默miR-146a組第1～4天逃避潛伏期均顯著高于正常組，穿越平臺次數均顯著低于正常組(P<0.05)；沉默miR-146a組第1～4天逃避潛伏期均顯著低于模型組、過表達miR-146a組，穿越平臺次數均顯著高于模型組、過表達miR-146a組(P<0.05)，見表1。

表1 各組學習記憶能力比較

2.3各組S100β、NSE、BDNF水平比較 與正常組比較，模型組、過表達miR-146a組、沉默miR-146a組大鼠S100β、NSE水平顯著升高，BDNF水平顯著降低(P<0.05)；與模型組、過表達miR-146a組比較，沉默miR-146a組S100β、NSE水平顯著降低，BDNF水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組S100β、NSE、BDNF水平及miR-146a、Bcl-2、caspase3比較

2.4各組miR-146a、Bcl-2、caspase3表達比較 與正常組比較，模型組、過表達miR-146a組、沉默miR-146a組miR-146a、Bcl-2、caspase3表達顯著升高(P<0.05)；沉默miR-146a組miR-146a、Bcl-2、caspase3水平顯著低于模型組、過表達miR-146a組(P<0.05)。見表2、圖2。

1～4：正常組、模型組、過表達miR-146a組、沉默miR-146a組圖2 Western印跡檢測Bcl-2、caspase3表達

2.5各組TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 模型組、過表達miR-146a組、沉默miR-146a組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著高于正常組(P<0.05)；與模型組、過表達miR-146a組比較，沉默miR-146a組TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

3 討 論

認知是機體腦組織接受、處理信息，并將信息轉化為心理活動，進而獲取所需知識、信息的過程，其中包括語言、計算、記憶、判斷、執行等，認知功能障礙是指一項或多項認知功能出現損傷，進而對日常生活能力、社會功能造成影響，及時防治認知功能障礙是預防老年癡呆的關鍵〔7，8〕。臨床常采用康復訓練、藥物等方式來進行恢復治療，但其發病機制在臨床醫學中尚未研究透徹，臨床治療效果并不十分理想〔9，10〕。專家學者通過多種途徑對認知功能障礙發病機制進行研究。其中miRNA在多種生物體中均存在，并且在自身運轉過程中與炎癥介質、免疫形態等相互作用〔11，12〕。研究表明，miR-146a表達變化與機體認知障礙情況具有密切聯系〔13，14〕。

認知功能障礙即機體記憶功能出現障礙，并對其神經系統造成嚴重損傷。徐巖等〔15〕研究發現有效的干預能夠發揮神經功能保護作用，改善認知功能障礙大鼠模型的學習記憶能力。本研究結果說明認知功能障礙大鼠學習記憶能力較差。本研究還發現，沉默miR-146a表達的認知功能障礙大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺次數明顯增加，原因可能是沉默miR-146a表達能夠改善認知功能、神經功能，提升學習、記憶能力，保護機體神經系統。

S100β在機體中以細胞形態存在，位于神經系統膠質細胞中，自身表達高低與神經系統損傷程度緊密關聯〔16〕。NSE作為一種酸性蛋白酶，在神經元細胞中廣泛存在，作用于細胞內糖酵解〔17〕。BDNF作為神經營養因子，主要存在于機體腦組織神經系統，具有保護神經系統的作用〔18〕。本研究結果說明認知功能障礙的發生發展伴隨著腦組織神經系統損傷，沉默miR-146a表達能調控S100β、NSE、BDNF水平，減輕認知功能障礙大鼠神經系統損傷嚴重程度。

研究發現減輕大鼠海馬區炎癥反應，能夠減輕神經系統損傷嚴重程度，從而減輕大鼠認知功能障礙〔19，20〕。TNF-α、IL-1β、IL-6是臨床常用的炎癥因子，檢測TNF-α、IL-1β、IL-6水平能夠對炎癥反應嚴重程度進行評價。本研究結果說明認知功能障礙伴隨著神經系統炎癥反應，沉默miR-146a表達能夠抑制TNF-α、IL-1β、IL-6水平，減輕大鼠海馬區炎癥反應，從而減輕大鼠認知功能障礙嚴重程度。

認知功能障礙、神經系統損傷與機體腦組織神經細胞凋亡之間具有極為緊密的關聯性。caspase3以蛋白酶形態存在，參與機體細胞的凋亡過程。Bcl-2以蛋白形態存在于機體當中，自身具有促進細胞存活的作用，其表達變化與細胞凋亡緊密關聯〔21，22〕。本研究結果原因可能是沉默miR-146a表達通過靶向調控線粒體細胞凋亡通路蛋白Bcl-2、caspase3表達，能夠對海馬區組織神經細胞的凋亡起到抑制作用，達到保護神經細胞的作用，減輕神經系統損傷、認知功能障礙嚴重程度。

綜上，沉默認知功能障礙模型大鼠miR-146a表達，能夠改善大鼠學習記憶能力，調控S100β、NSE、BDNF水平，靶向調控Bcl-2、caspase3表達，抑制大鼠海馬組神經細胞凋亡，減輕大鼠神經損傷嚴重程度以及腦組織炎癥反應。