泥炭水解液培養米曲霉的研究

摘要：本實驗研究了泥炭水解液對米曲霉滬釀3.042的孢子生長速度以及種曲蛋白酶活性和成曲蛋白酶活性的影響。

關鍵詞：泥炭酸（水）解液——peat水解液 生長速率——The rate of growth 蛋白酶酶活——The activity of protein

1 概述

泥炭是不完全分解的植物殘體堆積物。因為它是不完全分解產物的堆積物。其成份相當復雜：水、纖維素、半纖維素、腐殖酸、石蠟，還有少量游離的氨基酸與金屬離子。通過不同的酸，不同濃度的酸進行酸解，所得的泥炭水解液的成份及其組成含量均不盡相同，即使是用同一種酸、同種濃度，也會因為處理時間與處理的程序不同，泥炭水解液的成份及含量也有所差異。

對于泥炭的開發利用，在國外，是作為發酵工業基質原料來培養微生物，目前主要限于酵母菌和食用菌的某些種屬；在國內，早些時候，對泥炭的開發與利用，主要是將之作為一種建筑材料加以利用；目前，也曾有報道：泥炭水解液作為一些食用菌的發酵底物、熱帶假絲酵母生產單細胞蛋白（scp）。在這些對于泥炭的開發利用中，泥炭水解液是作為碳源，將之添加到培養基質中去的，且結果有一定程度的增產作用。我們觀察了泥炭水解液對米曲霉孢子發芽率、生長速率以及蛋白酶酶活的影響，現將結果報道如下：

2 材料與方法

2.1 菌種：滬釀3.042米曲霉，安徽大學生命科學院菌種室提供。

2.2 泥炭：采自安徽省繁昌縣。

2.3 培養基

2.3.1 （斜面）培養基：參照《發酵調味品生產技術》（上冊）。

2.3.2 三角瓶種曲培養基：豆餅：麩皮=20：80，含水量與干料100%。

2.3.3 成曲培養基：同2.3.1——麩曲培養基：10豆餅/1麩皮。

2.4 泥炭水解液制備：參考A.M.Martin等人的方法。

2.5 細胞培養：二次活化，再低濃度梯度，peat水解液培養訓化，最后三角瓶擴大，成曲制備等實驗。

2.6 試驗方法

本實驗按泥炭水解液含量分6個試驗組種曲，成曲培養基中泥炭水解液含量分別為：0%、10%、15%、20%、25%、30%。

2.6.1 種曲接種：取7支經訓化階段的30%度管菌種，再支加無菌水3ml，輕劃后倒入無菌玻璃珠三角瓶制成孢基液，以接種量為1ml/支（三角瓶）接種到含peat水解液的試驗組；取3支同樣階段的對照試管菌種，重復上述步驟，以相同接種量接種至對照組。29-31℃培養，18.5h第一次翻曲，24h第二次翻曲，再培養2天即可。

2.6.2 成曲接種：分別取對照，30%的種曲5g于無菌水+玻珠的三角瓶內制成孢基液，對應接種，接種量為1ml/支（三角瓶）30-25℃培養，11.5h第一次翻曲，18h第二次翻曲，27h成曲成熟。

2.6.3 種曲蛋白酶活測定時的接種量同2.6.2，30-35℃培養，18h第一次翻曲，24.5h第二次翻曲，繼續培養至66h即可。

2.6.4 酶活測定：參照Folin法測蛋白酶活，在40℃下，每分鐘水解絡蛋白產生1mg絡氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。

蛋白酶活力單位=A/10×4N

其中A為樣品測得的OD值，查標準曲線得到的酷氨酸的微克數。

10克為反應時間是10分鐘。

4為4ml反應液中取1ml測來（即4倍）。

N為酶液稀釋倍數。

3 結果與討論

3.1 peat水解液對滬釀3.042生長速度影響：

注：表1中長度指的是孢子平面向下延伸的長度。

從表1可看出隨時間的延長，孢子平面向下加快延伸，但后一階段增長百分比一般比前一階段增長百分值低，這與越向下，培養基通氣情況越差有關；隨peat水解液含量的增加，延長速率也加快，說明peat水解液對3.042的生長速率有較明顯的刺激作用。

3.2 peat水解液對3.042蛋白酶活性影響。

3.2.1 peat水解液對于3.042種曲蛋白酶活影響

種曲蛋白酶的多少雖與最后的發酵關系不大，但它活性大小可反映種曲的質量，也一定程度上反映出種曲的孢子數多少；考慮種曲中提取高活性的蛋白酶用于后期發酵，以縮短發酵周期，改善醬油風味等方面提供一條思路。

從表2可看出此種種曲蛋白酶（中性）酶活多數在2-3×103單位之間，且隨peat水解液濃度的升高，蛋白酶活性亦隨之增加，說明peat水解液對種曲蛋白酶活有一定程度上的刺激作用。

3.2.2 peat水解液對滬釀3.042成曲蛋白酶活影響

成曲蛋白酶活性大小，是醬油釀造中成曲質量高低的一個重要指標；同時成曲酶活也將直接影響后期發酵周期長短，醬油質量的優劣、原料中N源利用率高低等許多方面。

從表3可以看出此種成曲蛋白酶活性多在1-2×103單位之間。近種曲酶活性的一半；隨peat水解液含量的增加，成曲中蛋白酶活性有一定程度的增加，說明peat水解液對滬釀3.042成曲蛋白酶活有一定的促進作用。

4 小結與思考

以上通過討論peat水解液對米曲霉滬釀3.042的影響，結果表明：尤其是生長速率和種曲、成曲蛋白酶活，其促進作用在本實驗中最高可達：生長速率+15.88%，種曲酶活可達+23.04%，成曲酶活可達+29.53%，由本實驗結果可得出以下結論：

①peat水解液對于滬釀3.042生長速率及種曲、成曲蛋白酶活則有較明顯的刺激作用，其中，peat水解液含量為30%的試驗組所得結果最為明顯。

②考慮到peat水解液成份含量的不均一性及其制備工藝的繁瑣性，不易大規模生產，但實際生產過程中可以考慮把peat水解液作為生長因子添加到培養基質中去，為醬油釀造新工藝的選擇與設計提供一點參考。

③由本實驗結果可以看出，peat水解液對滬釀3.042蛋白酶活性有相當的刺激作用，由此可以得到點啟發：peat水解液在酶制品工藝方面可能有廣闊的應用前景，這還須進一步研究。

參考文獻：

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