固相萃取高效液相色譜法測定蛋和肉中的三聚氰胺

摘要：建立快速靈敏的測定蛋和肉中三聚氰胺的高效液相色譜分析方法。考察了樣品中三聚氰胺在酸性和堿性條件下水解的穩定性。試驗選用強堿水解樣品，采用強陽離子固相萃取柱萃取，高效液相色譜分析。工作曲線線性范圍超過0.4～10ug/mL，三聚氰胺檢測限為0.06ug/mL(S/N=3)，相對標準偏差都小于2%（n=5），平均回收率分別在93%-97%。建立的方法適用于蛋和肉中三聚氰胺的定量定性分析。

關鍵詞：三聚氰胺 固相微萃取 高效液相色譜

繼2007年3月美國召回大量被三聚氰胺的飼料，三聚氰胺成為社會熱點話題[1，2]，在我國2008年9月三聚氰胺再次成人們關注的熱點，多數國內知名品牌奶粉發現被三聚氰胺污染。國家立刻采取相應措施，在2008年10月初出臺了原料乳和乳制品中三聚氰胺檢測國家標準。對于食品和飼料中三聚氰胺檢測研究主要集中于近年[3-4]，一些不法分子利用現行蛋白含量分析的漏洞，為了提高飼料和食品檢出含量而向其中惡意添三聚氰胺，在國外都造成了惡劣影響。三聚氰胺的分析方法主要為高效液相色譜法[5]、液相色譜質譜法[6]和液相色譜-串聯質譜法[7]，其中以高效液相色譜法最為簡單經濟。如今以出臺飼料和乳制品中的三聚氰胺檢測的國家標準，還未有關于蛋和肉制品中的三聚氰胺檢測方法的報道。依據當前形勢，建立蛋和肉制品中的三聚氰胺檢測方法迫在眉睫。本文采用固相萃取/液相色譜法快速檢測蛋和肉制品中的三聚氰胺，方法分析速度快、靈敏度高，適用于蛋和肉中三聚氰胺的定量定性分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津高效液相色譜儀，配10ATVP輸送泵，SPD-10A檢測器(日本，島津公司)。混合型陽離子交換同相萃取柱（strata-X-C， 60mg/3ml，菲羅門公司）；

三聚氰胺：分析純，純度不低于99.5%；其余化學試劑均為國產分析純。

三聚氰胺標準儲備液：精確稱取三聚氰胺20mg，40%定容至100ml，制得200μg/ml標準儲備液。

1.2 色譜條件

色譜柱：Luna5uC8(2)100A（250×4.6mm）；檢測波長240nm，柱溫：常溫；流動相：緩沖液：乙腈=85:15；緩沖液：10mmol/L檸檬酸，10mmol/L庚烷磺酸鈉；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL。

1.3 樣品處理

稱取攪勻樣品5g于100ml容量瓶中，依次加入6mol/L氫氧化鈉或鹽酸2mL樣品，水域60℃水解3h，水解液調pH至3左右，用10g/L三氯乙酸溶液定容至刻度后過濾，取濾液2ml上分別用3ml水和3ml甲醇活化后的強陽離子固相提取柱，控制流速，大約1ml/min，分別使用3ml甲醇和3ml水淋洗后，用3ml5%的氨水-甲醇（V/V）洗脫，洗脫液收集與10ml離心試管。50℃下用N2吹干后，加流動相2ml，渦旋震蕩1min，過0.2μm有機濾膜，進樣10μl經HPLC分析。

2 結果與討論

2.1 三聚氰胺在強酸和強堿條件下穩定性考察

為了充分提取蛋和肉樣品中的三聚氰胺，需要對樣品進行水解。水解方式一般有堿水解、酸水解和酶水解。酶水解雖然條件溫和、對分析物破壞程度小，但成本偏高，故而在可以使用堿水解、酸水解是不使用酶水解。試驗考察了在6M氫氧化鈉和6M鹽酸的強堿、強酸條件下，60℃加熱3小時的穩定性。分別稱取攪勻的三聚氰胺陰性鮮雞蛋5g于15只100ml容量瓶中，分別加入200μg/ml三聚氰胺標液5ml，其中5只加三氯乙酸溶液超聲提取，5只加6M氫氧化鈉溶液2ml，5只加6M鹽酸溶液2ml于60℃水浴加熱3小時。三組試驗的回收率見圖1，樣品平均加標回收率為：不水解為95.4、酸水解為96.8%、堿水解為97.6%。試驗說明三聚氰胺在強堿和強酸條件下穩定，分析含三聚氰胺的樣品時可以使用強堿或強酸進行水解。本試驗選用堿水解。

2.2 方法分析特性

使用200μg/mL儲備液，制得標準系列濃度為：0.4、0.8、2.0、4.0、10.0μg/mL。經HPLC分析（標準溶液色譜圖見圖2），以面積為縱坐標，分析物濃度為橫坐標，得標準曲線。曲線方程為：y=8558.6x+2430.7（r=0.9997）。三聚氰胺的檢測限為0.063μg/mL（S/N=3），用所配標準溶液測定方法的重復性，選用1μg/mL、4μg/mL和10μg/m標準溶液計算回收率，平均回收率均分別為93.8%（RSD=0.89%）、95.0%（RSD=1.9%）和96.8%（RSD=0.86%），說明此方法滿足實際分析要求。

2.3 討論

試驗中發現經過堿水解或酸水解后，樣品的加標回收率要高于普通的加標回收率，其中以堿水解樣品的加標回收率最高，可能是因為在萃取前要調節pH值，使得溶液中離子強度增強，起到了鹽析作用，在調節pH至酸性時，堿水解樣品的離子強度最高。

對于鮮蛋樣品的分析，可以不必對樣品進行水解，可以直接加入三氯乙酸溶液，超聲震蕩15min后，加入5ml乙酸鋅沉淀劑后用三氯乙酸溶液定容、過濾后直接上強陽離子交換柱，可以大大縮短樣品的分析時間。

參考文獻：

[1]侯艷麗，張惠茹，劉來亭等.三聚氰胺的檢測方法[J].飼草飼料，2007，28(29):32-33.

[2]張俊燕，何呂興.三聚氰胺的樣品前處理及最新檢測方法[J].生命科學儀器，2007，5：57-59.

[3]Roberto Mu?觡iz-Valencia，Silvia G. Ceballos-Maga?觡a， Daniel Rosales-Martinez，et al. Method development and validation for melamineand and its derivatives in rice concentrates by liquid chromatography. Application to animal feed samples [J].Anal Bioanal Chem，2008，392:523-531.

[4]丁濤，徐錦忠，李健忠等.高效液相色譜-二極管陣列檢測法及高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定植物源性蛋白中殘留的三聚氰胺[J].色譜，2008，26(1):6-9.

[5]Shin Ono，Tatsuo Funato，Yasuhiko Inoue，et al. Determination of melamine derivatives，melame，meleme，ammeline and ammelide by high-performance cation-exchange chroma

tography [J].Journal of Chromatography A，1998，815:197-204.

[6]黃芳，黃曉蘭，吳惠勤等.高效液相色譜-質譜法對飼料及食品添加劑中三聚氰胺的測定[J].分析測試學報，2008，27(3): 313-315.

[7]劉梅，李金強，田德金等.固相萃取-液相色譜-串聯質譜法檢測食品中的三聚氰胺[J].化學分析計量，2008，17(2):48-50.