IGF—ⅠR抑制劑聯合西妥昔單抗對人肝癌細胞的體外抑制作用

[摘要] 目的 探討西妥昔單抗與胰島素樣生長因子—Ⅰ受體（IGF—ⅠR）抑制劑aIR3對人肝癌細胞株HepG2細胞的作用。 方法 選用濃度遞增的西妥昔單抗（5～500） mg/mL和aIR3（2.5～250.0） μmol/L，單獨或聯合作用于HepG2細胞，觀察不同時間對細胞增殖的抑制作用以及聯用時的兩藥協同系數。 結果 單藥西妥昔單抗與aIR3對HepG2細胞增殖的抑制作用均呈濃度依賴性與時間依賴性，二藥單獨作用于HepG2細胞72 h最大抑制率分別為42.2%、82.3%，二藥聯合作用于HepG2細胞72 h最大抑制率達91.8%。西妥昔單抗與аIR3不同濃度在各時間點的協同系數均小于1。 結論 西妥昔單抗和aIR3在體外對HepG2細胞的增殖均具有一定的抑制作用，聯合應用時具有明顯的協同效應。

[關鍵詞] 肝癌細胞株；表皮生長因子受體；西妥昔單抗；胰島素樣生長因子—Ⅰ受體；aIR3

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673—9701（2012）26—0001—03

Effects of cetuximab combined with inhibitor of IGF—ⅠR on proliferation of human hepatocellular carcinoma cell lines HepG2

HAN Chunfan1 CHEN Yingrong2 CAI Weilong1 XIE Zhonghai1 WANG Yan1 SHEN Hua1 MIN Lishan2 WEI Feng1 DAI Licheng2

1.Department of Surgery， Huzhou Central Hospital， Huzhou 313000， China； 2.Huzhou Key Molecular Medical Laboratory， Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To evaluate the effects of cetuximab combined with inhibitor of insulin—like growth factor—Ⅰreceptor （IGF—ⅠR） aIR3 on proliferation of human hepatocellular carcinoma cell （HCC） lines HepG2. Methods Increasing concentrations of cetuximab （5—500） mg/mL and aIR3 （2.5—250.0） μmol/L， alone or in combination were administrated to HepG2 cells. The inhibitory effects of the drugs on cell proliferation at different time points were observed；the combination index （CI） of these two agents was calculated. Results The single agent of cetuximab and aIR3 inhibited the proliferation of HCC cells in a time— and dose—dependent manner. After treatment 72—hour，the proliferation inhibition rates of HepG2 cells were 42.2% and 82.3%. With maximal inhibitory effects of cetuximab combined aIR3， the proliferation inhibition rates of HepG2 was 91.8%. The CIs of different concentrations of the two agents at different time points were all less than 1， suggested that they have obvious synergistic activity. Conclusion The single agent of cetuximab and aIR3 can inhibit the proliferation of HepG2 cells， and they have obvious synergistic activity.

[Key words] Liver cancer cell lines； Epidermal growth factor receptor； Cetuximab； Insulin—like growth factor—Ⅰ receptor； aIR3

原發性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，死亡率居各種惡性腫瘤的第二位[1]。研究發現，原發性肝癌患者的肝癌組織與癌旁肝組織常高表達表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），后者與肝癌侵襲、轉移、放化療抗性等生物學特性密切相關[2]。EGFR抑制劑是一類新型靶向治療藥物，其中西妥昔單抗對人肝癌細胞增殖的抑制作用已有許多報道[3]。胰島素樣生長因子—Ⅰ受體（insulin—like growth factor—Ⅰreceptor， IGF—ⅠR）信號通路在肝癌生長中的重要作用及IGF—ⅠR抑制劑對肝癌的抑制作用亦有文獻報道[4]，但IGF—ⅠR抑制劑與西妥昔單抗聯合應用對人肝癌細胞增殖的抑制作用是否存在協同作用目前仍無文獻報道。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

西妥昔單抗與IGF—ⅠR抑制劑aIR3均購自德國默克制藥公司，CCK—8細胞計數試劑盒產自日本同仁化學研究所，RPMI—1640細胞培養液、10%新生小牛血清、含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的雙抗、0.25%胰酶溶液購自美國Gibco公司，分析純二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。

1.2 細胞培養

人肝癌細胞株HepG2購自中科院上海細胞所，細胞培養液為含10%小牛血清、含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI—1640培養液，置于37℃、5%CO2、85%濕度的恒溫培養箱中培養，每3～4天傳代1次，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 細胞生長抑制實驗

分為5組，包括空白對照組、細胞對照組、西妥昔單抗組、aIR3組、aIR3與西妥昔單抗聯合組，每組含3個復孔。HepG2細胞通過0.25%胰酶溶液消化，用RPMI—1640培養液稀釋并接種于96孔培養板，調整細胞密度達3×104/mL，置于恒溫箱中培養。兩藥單用時劑量分別為西妥昔單抗（5～500） mg/mL，aIR3（2.5～250.0） μmol/L，詳見表1，2。兩藥聯用時，按上述藥物劑量保持固定比例，詳見表3。分別培養24 h，48 h，72 h，通過酶標儀測定各組吸光度值（A值），并計算各組細胞增殖抑制率。

1.4 統計學方法

根據藥物協同作用中效原理，計算各組抑制率均數，經生物軟件CalcuSyn計算不同時間點、不同濃度的兩藥聯合作用于HepG2細胞的協同系數（combination index，CI）。

2 結果

2.1 西妥昔單抗對HepG2細胞的作用

單藥西妥昔單抗對HepG2細胞有明顯抑制作用，且呈顯著的時間依賴性與濃度依賴性，隨藥物濃度增加與作用時間延長其抑制作用也顯著增強，見表1、圖1。作用72 h后其最大增殖抑制率為42.2%。

2.2 aIR3對HepG2細胞的抑制作用

aIR3以時間與濃度依賴性方式抑制HepG2細胞的增殖，見表2、圖2。培養72 h后其最大增殖抑制率達82.3%。

2.3 西妥昔單抗聯合aIR3對細胞的抑制作用

西妥昔單抗聯合aIR3可顯著抑制HepG2細胞的增殖，其抑制率較單藥顯著升高，作用72 h后，其最大增殖抑制率達91.8%，見表3、圖3。

2.4 西妥昔單抗與aIR3的協同作用系數

利用CalcuSyn軟件計算兩藥不同濃度在各時間點的CI值，結果顯示各時間點的CI值均小于1，提示西妥昔單抗與aIR3可協同抑制HepG2細胞的增殖，見表4。

3 討論

原發性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其治療仍以外科手術為首選，但手術后易于復發轉移，傳統的化療和放療療效不佳，極大地影響了其療效與預后[5]。近年來分子靶向治療技術的飛速發展則為肝癌提供了一個新的治療途徑，EGFR抑制劑則是最受關注的領域之一。EGFR在許多惡性腫瘤中過高表達，并且EGFR高表達的惡性腫瘤患者預后較差。肝癌細胞中也常有表皮生長因子受體的表達，并與肝癌患者的臨床分期、肝內外轉移及組織分化程度等有關[6]。西妥昔單抗是一種人—鼠嵌合抗EGFR IgG1 MAb，屬于作用于胞外區的單克隆抗體，已被批準用于治療依立替康復發的轉移性結腸癌，對肝癌的抑制作用亦有文獻報道。IGF—ⅠR廣泛表達于多種類型的細胞表面，對正常細胞的生物學行為有著極其重要的作用，當其表達過度時，細胞可以向惡性表型轉化。在多種腫瘤中均已檢測到IGF—ⅠR及其配體的表達異常。以IGF—ⅠR為靶點的實驗研究也屢見報道。胰島素樣生長因子Ⅰ型受體單克隆抗體аIR3對腫瘤的抑制作用已有不少報道[7]，但аIR3與西妥昔單抗聯合應用抑制肝癌細胞增殖尚未見文獻報道。

在本研究中，西妥昔單抗與аIR3作用于人肝癌細胞株HepG2細胞72 h后，其最大增殖抑制率分別為42.2%、82.3%，二藥聯合作用于HepG2細胞72 h后，最大抑制率達91.8%。西妥昔單抗與аIR3不同濃度在各時間點的CI值均小于1，表明二藥合用對HepG2細胞的增殖有顯著的協同抑制作用。研究表明，西妥昔單抗與EGFR特異性結合后，通過增加細胞周期抑制因子p27kip 的表達，誘導細胞停留于G1期，從而抑制細胞增殖；通過增加凋亡促進基因Bax表達和減少凋亡抑制基因bcl —2表達而誘導腫瘤細胞凋亡[8]。有文獻報道，aIR3可通過阻滯細胞周期、誘導凋亡等途徑抑制肝癌細胞增殖。還有報道，aIR3除可抑制IGF— I R功能及其下游受體絲氨酸/蘇氨酸Akt的磷酸化，還可降解IGF— I R。aIR3封閉IGF— I R，在體外可消除IGF— I R促增殖、抑制凋亡的作用，從而抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，達到治療目的[9]。因此，西妥昔單抗與аIR3誘導腫瘤細胞凋亡的機制不同可能是其協同抑制HepG2細胞增殖的主要原因。但二藥在體內對肝癌細胞的抗增殖作用及其詳細的作用信號通路尚需進一步研究。

[參考文獻]

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（收稿日期：2012—05—08）