Notch1在調(diào)節(jié)小細胞肺癌多藥耐藥中的作用

[摘要] 目的 探討Notch1在小細胞肺癌多藥耐藥中的作用。 方法 首先通過QRT—PCR和Western—blot從基因和蛋白水平檢測小細胞肺癌敏感細胞株（H69）和耐藥細胞株（H69AR）中Notch1的差異表達；應用siRNA抑制耐藥細胞株H69AR中的Notch1的表達，通過CCK8檢測細胞對各種化療（ADM，DDP，VP—16）的敏感性，流式細胞儀檢測細胞凋亡率的變化。 結(jié)果 Notch1在H69AR中的表達明顯高于H69，抑制耐藥細胞株中Notch1的表達能夠增加細胞對化療藥物的敏感性，促進細胞的凋亡。 結(jié)論 Notch1可能參與了調(diào)節(jié)小細胞肺癌對多藥耐藥性。

[關(guān)鍵詞] Notch1；多藥耐藥；小細胞肺癌

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673—9701（2012）26—0006—03

The role of Notch1 on regulating multi—drug resistance in small cell lung cancer

FENG Liping SU Wenmei

The Third Branch of Cancer Center，the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524000，China

[Abstract] Objective To investigate the role of Notch1 on regulates multi—drug resistance in small cell lung cancer. Methods Detected by Western blotting and real—time PCR（RT—PCR）， differential expression of Notch1 gene and protein in both the drug— sensitive cell line H69 and ADM—resistant cell line H69AR. The Notch1 expression was blocked by the SiRNA in H69AR.Then the sensitivities of cells to chemotherapy drugs such as ADM， DDP， VP—16 were detected by CCK8 assay， apoptosis rate by flow cytometry. Results The expression of Notch1 was significantly increased in H69AR cells than in the H69 cells. The sensitivities of H69AR cells to chemotherapy drugs were increased when down—regulated the expression of the Notch1，with the apoptosis were increased. Conclusion Notch1 may associate with chemotherapy resistance of small cell lung cancer.

[Key words] Notch1；Multidrug resistance；Small cell lung cancer

最新統(tǒng)計資料顯示肺癌已成為當今世界第一高發(fā)癌，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢，小細胞肺癌（SCLC）的發(fā)病率約占原發(fā)性肺癌的15%～20%[1]。由于SCLC具早期發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的傾向，因此全身化療為其治療重點，雖然SCLC患者對化療敏感，但極易產(chǎn)生抗藥性而導致化療失敗，臨床預后差[2，3]。因此，化療抗藥性已成為目前小細胞肺癌臨床治療急需解決的問題之一。Notch1屬于Notch跨膜受體家族，參與介導多種細胞的凋亡、增殖和細胞分化多效性作用，最近研究結(jié)果顯示Notch1具有促癌和抑癌雙重作用，其信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展成為目前研究熱點[4]。我們前期通過基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)Notch1在H69AR中的表達較H69明顯增高，本實驗旨在進一步驗證Notch1在小細胞肺癌敏感細胞株H69和其阿霉素耐藥株H69AR中的表達，以及其表達對小細胞肺癌化療藥物耐藥性及細胞凋亡的影響。

1材料與方法

1.1 材料

人小細胞肺癌敏感細胞株（H69）及其阿霉素耐藥株（H69AR）均購自美國ATCC， 新生胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；順鉑、阿霉素和依托泊苷購自輝瑞公司；CCK8及凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天公司第1鏈cDNA合成試劑盒、聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒購自大連寶生生物公司；兔抗人單克隆抗體Notch1購自美國Santa Cruz公司；羊抗兔二抗購自武漢博士德生物公司。

1.2 實時熒光定量PCR分析EAG1的mRNA表達

提取細胞中的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR。Notch1上游引物為5’—CGCCAGAGTGGACAGGTCAGTA—3’，下游引物為5’— GCAGTTGGAGCCCTCGTTA—3’；內(nèi)參照GAPDH上游引物為5’—GGAAGGACTCATGACCACAGTCC—3’，下游引物為5’—TCGCTGTI'GAAGTCAGAGGAGACC—3’ 逆轉(zhuǎn)錄反應及PCR參照試劑盒說明，以Nocth1基因的上下游引物進行PCR擴增，PCR反應在實時定量PCR反應儀上進行。三次獨立實驗后得到的數(shù)據(jù)運用公式RQ=2—△△Ct的方法進行分析。

1.3 SiRNA下調(diào)Notch1的表達

將合成的SiRNA轉(zhuǎn)染入H69AR細胞，轉(zhuǎn)染前 24 h將細胞按5×105個/mL密度接種于6孔板，轉(zhuǎn)染時細胞融合度為70%左右，將500 μL Opti—MEM或者無血清培養(yǎng)基稀釋 3 μL LipofectamineTM 2000，輕輕吹吸 3～5 次混勻，室溫下靜置 5 min；將3 μL干擾片段稀釋于500 μL Opti—MEM或者無血清培養(yǎng)基中，輕輕吹吸3～5次混勻；混合轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒稀釋液，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫下靜置 20 min；轉(zhuǎn)染復合物加入到 6孔細胞板中，1mL/孔，前后輕搖細胞板混合均勻。細胞板置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4～6 hrs 后換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24 h檢測基因表達的變化，48 h后檢測蛋白的表達。

1.4 Western blotting分析Notch1蛋白表達

提取細胞總蛋白，BCA法蛋白定量，每孔中加樣50 μg蛋白，經(jīng)8%SDS—PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%BSA/TBST室溫封閉1 h，加入兔抗人Notch1單克隆（1：200）孵育，4℃過夜。TBST漂洗三次，用 HRP標記的羊抗兔IgG（1：5000）孵育，室溫2 h，TBST漂洗三次，ECL檢測，暗室曝光10 s～10 min，顯影。

1.5 CCK8法檢測藥物敏感性

參照順鉑（DDP）、足葉乙甙（VP—16）及阿霉素（DOX）3 種化療藥物的血漿高峰濃度，在各種轉(zhuǎn)染細胞中分別加入 0.01 倍、0.1 倍、1 倍和 10 倍血漿高峰濃度的化療藥物，每種藥物的每一濃度設 4 個重復孔；陰性對照組：僅加細胞不加藥物，設 4 個重復孔；空白調(diào)零組：僅加細胞培養(yǎng)液，設4個重復孔。以每孔 3×103個細胞接種于 96 孔培養(yǎng)板中，每孔加入200 μL培養(yǎng)液；細胞貼壁后，將3種化療藥物按不同濃度加入各孔細胞，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng) 24 h；每孔加新鮮配制的CCK8溶液20 μL，37℃、5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng)0.5～4 h 后，終止培養(yǎng)。選擇 450 nm 波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，取每 4 個重復孔的光吸收值（A 值）的平均值，計算各種轉(zhuǎn)染細胞在3 種化療藥物不同濃度下的存活率；細胞存活率=（實驗組 A 值—空白對照組 A 值）/（陰性對照組 A 值—空白對照組 A 值）×100%。重復實驗三次，取平均值，以細胞存活率為縱軸，藥物濃度對數(shù)為橫軸作半對數(shù)圖，并按作圖法求出 3 種藥物的 IC50 值。

1.6細胞凋亡檢測

對數(shù)生長期的細胞及原代細胞H9C2 以 4×105/孔接種于6 孔板中；37℃培養(yǎng) 48 h；收集細胞，PBS 洗滌 2 次；細胞重懸于 100 μL 含 Annexin V—FITC 和 0.5 μg PI 的結(jié)合緩沖液（10 mM HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，5 mM KCl，1mM MgCl2， 1.8 mM CaCl2）中；光室溫孵育15 min；加入400 μL 結(jié)合緩沖液；流式細胞儀分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料采用t檢驗或One—way ANOVA檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 Notch1在敏感株（H69）和耐藥株（H69AR）中的表達

如圖1A所示，QRT—PCR結(jié)果顯示H69AR細胞株中Notch1的mRNA表達較H69細胞明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P = 0.003）。Western blot結(jié)果也顯示在耐藥株H69AR中的Notch1蛋白的表達較敏感株H69顯著升高（見圖1B，P = 0.000）。

2.2 通過SiRNA下調(diào)H69AR細胞株中Notch1的表達

如圖2所示，H69AR細胞轉(zhuǎn)染Notch1的小干擾RNA后，Notch1在 mRNA和蛋白水平上均明顯降低（P = 0.004），差異有統(tǒng)計學意義。

2.3細胞藥物敏感性的變化

CCK8檢測示H69AR對順鉑（DDP），阿霉素（ADM）及依托泊苷（VP—16）的敏感性較H69明顯降低（圖3A，P = 0.009）。應用小干擾RNA在H69AR細胞株中下調(diào)Notch1的表達后，與對照組相比細胞對DDP，ADM及VP—16的敏感性明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（圖3B，P = 0.02）。

圖3 細胞對化療藥物敏感性的檢測，A：cck8檢測H69和H69AR細胞對化療藥物DDP，ADM及VP—16的敏感性；B：通過小干擾RNA下調(diào)H69AR中Notch1的表達后，細胞對DDP，ADM及VP—16的敏感性明顯增加（**P < 0.01，*P < 0.05）；DDP：順鉑；ADM：阿霉素；VP—16：依托泊苷

2.4 細胞凋亡率的變化

流式細胞技術(shù)檢測顯示，H69組凋亡率為（22.94±0.74）%，H69AR細胞凋亡率為（9.13±0.1）%（P < 0.01），兩組之間差異有統(tǒng)計學意義。而H69AR—Si—Notch1組凋亡率為（18.104±0.198）%（P < 0.01），下調(diào)Notch1明顯促進H69AR細胞凋亡。

3 討論

Notch基因發(fā)現(xiàn)于1919年，其突變可造成果蠅的殘翅，隨后發(fā)現(xiàn)其家族成員的結(jié)構(gòu)具有高度保守性，在細胞分化、發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。目前在人體細胞中共發(fā)現(xiàn)了4個Notch同源體，包括Notch1、Notch2、Notch3、Notch4。Notch1基因編碼的單鏈跨膜糖蛋白，是保守的細胞膜表面受體，配體與Notch1受體胞外區(qū)表皮生長因子樣重復序列（EGF—Like repeat）結(jié)合后構(gòu)象的改變激活了金屬蛋白酶家族的TNFa轉(zhuǎn)化酶（TA—CE）和促分泌酶（Secretasc）分別對胞外S2位點和跨膜S3位點剪切，膜上釋放Notch1的胞內(nèi)區(qū)（NICD）轉(zhuǎn)移人核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控下游基因的表達或通過復雜的信號網(wǎng)絡發(fā)揮效應。Notch1與腫瘤的關(guān)系復雜，目前存在爭論，一方面Notch1抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞增殖，參與調(diào)解腫瘤的多藥耐藥，如可抑制Hela細胞p27 Kip1的表達，進而減少細胞周期激酶的滅活，促進腫瘤細胞通過細胞周期，在前列腺癌細胞中下調(diào)Notch1的表達能夠抑制細胞生長，誘導細胞凋亡[5，6]；在膠質(zhì)瘤細胞中抑制Notch1能夠增加細胞對放療的敏感性，促進細胞凋亡[7]的表達能夠增加在耐藥的乳腺癌細胞株MCF7/VP中的表達較非耐藥細胞明顯增高，同時過表達Notch1能夠增加與耐藥相關(guān)的基因ABCC1的表達[8]。另一方面可以促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤生長，如在腦膠質(zhì)瘤中通過活化P53的表達，促進細胞凋亡，從而抑制細胞增長[9]。Notchl通路具有多樣性和復雜性，而其與腫瘤耐藥的關(guān)系，目前報道尚少。本實驗在前期對小細胞肺癌耐藥細胞株和敏感細胞株高通量芯片篩選中發(fā)現(xiàn)，耐藥細胞株中Notch1的表達明顯增高，為了進一步驗證芯片結(jié)果，我們進一步從基因和蛋白水平檢測了小細胞肺癌中Notch1的表達，和芯片結(jié)果一致。同時通過SiRNA下調(diào)Notch1的表達后，發(fā)現(xiàn)細胞對化療藥物的敏感性明顯增加，流式細胞儀檢測顯示下調(diào)Notch1的表達后細胞凋亡明顯增加，Notch1可能通過抑制細胞凋亡來影響小細胞肺癌的耐藥，本實驗為小細胞肺癌的耐藥機制的研究提供了一定的理論基礎和研究方向。

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（收稿日期：2012—07—18）