小鼠睪丸輸出管注射法建立轉(zhuǎn)基因小鼠的試驗(yàn)研究

摘要：應(yīng)用玻璃針將脂質(zhì)體包裹的質(zhì)粒pEGFP-C1通過(guò)睪丸輸出管注射到4周齡昆明（KM）小白鼠睪丸曲精細(xì)管內(nèi)。共注射6只小鼠，其中一只注射后馬上做石蠟切片觀察轉(zhuǎn)染液注射入曲細(xì)精管內(nèi)的情況，其他5只繼續(xù)飼養(yǎng)，1周后取1只小鼠培養(yǎng)睪丸的支持細(xì)胞，觀察是否有熒光出現(xiàn)。4周后，用PCR法檢測(cè)剩余4只小鼠睪丸組織曲細(xì)精管基因組中的外源DNA，4只都顯示為陽(yáng)性。表明用睪丸輸出小管注射法將外源基因?qū)胄∈蟛G丸是一條簡(jiǎn)便可行的新途徑。

關(guān)鍵詞：小鼠；轉(zhuǎn)基因；睪丸輸出管注射法

中圖分類號(hào)：S865.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.04.008

Construction of Transgenic Mice by Testicular Efferent Duct Injection

WANG He1，2， CAO Wen-guang2

（1. College of Animal Science， Xinjiang Agriculture University， Urumqi， Xinjiang 830052， China； 2.Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract： Using glass needle plasmid pEGFP-C1 liposome-encapsulated was injected into the testicular efferent of 4 weeks male KM mice. Do immediately after an injection of paraffin sections to obserne the transfection solution was injected into the seminiferous tules， remanent mouse to continue to raise， after a week， take one mouse cultivating testicular sertoli cells. After four weeks， exogenous DNA in the PCR method for detecting the remaining four mouse testis seminiferous tubules genome， all as positive. The result indicated that the data in this study to transgenic animals could be established by testicular efferent injection.

Key words： mice；transgenic；testis efferent injection

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物制藥等領(lǐng)域有著廣泛的研究和應(yīng)用前景， 因此，科學(xué)家們一直在探索一種更簡(jiǎn)便易行、經(jīng)濟(jì)實(shí)用而又高效的轉(zhuǎn)基因方法。有研究者應(yīng)用曲細(xì)精管微注射法建立了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[1-4]，該方法只需注射、交配、檢測(cè)3個(gè)步驟，簡(jiǎn)便易行。精原干細(xì)胞的移植首先由Brinstre等[5]報(bào)道，他們先將可育小鼠的混合生精細(xì)胞移入不育小鼠的曲細(xì)精管，結(jié)果在受體睪丸內(nèi)產(chǎn)生了具有受精能力的精子。目前，利用雄性動(dòng)物生殖細(xì)胞建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法成為許多科學(xué)家關(guān)注的對(duì)象。將攜帶外源基因的轉(zhuǎn)染液注射到睪丸曲細(xì)精管中[6]，體內(nèi)直接轉(zhuǎn)染生殖細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因精子，通過(guò)動(dòng)物自然交配最終獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這種體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法簡(jiǎn)單，易于操作，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物周期短，制備環(huán)節(jié)少。就目前而言，最大的優(yōu)點(diǎn)是成功避開(kāi)了體外培養(yǎng)生殖干細(xì)胞的困難。本試驗(yàn)用顯微注射針將脂質(zhì)體包裹的質(zhì)粒載體pEGFP-C1，通過(guò)睪丸的輸出小管注射到KM白小鼠的曲細(xì)精管中，成功將外源基因?qū)氩G丸組織，旨在探索一條新的、簡(jiǎn)單可行的建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的途徑。

1材料和方法

1.1材 料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)40日齡雄性KM小鼠6只，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2主要試劑質(zhì)粒pEGFP-C1（本實(shí)驗(yàn)室留存）。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司。脂質(zhì)體lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司。臺(tái)盼藍(lán)、DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEN培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。引物合成由上海生工生物工程公司完成。動(dòng)物組織DNA基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3試驗(yàn)器材體視解剖鏡，玻璃管（100×0.1 mm），酒精燈，打火機(jī)，1 mL的注射器，手術(shù)器械（用前需消毒），臺(tái)盼藍(lán)（0.4%），生理鹽水稀釋的戊巴比妥納（注射時(shí)濃度一般為1%）。

1.2方 法

1.2.1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化提取pEGFP-C1轉(zhuǎn)化入空白感受態(tài)菌種，鋪板并用卡那霉素篩選后，挑取陽(yáng)性克隆，大量培養(yǎng)，用Promega質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，過(guò)濾除菌分裝后，置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2注射用玻璃針的制作將玻璃管用酒精燈灼燒的辦法拉成玻璃針，將針尖打磨成30°的斜面。一小段橡膠管一頭連接注射器，一頭連接拉好的玻璃針，準(zhǔn)備注射使用。

1.2.3轉(zhuǎn)染液的配制按脂質(zhì)體試劑Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)，把載體pEGFP-C1與脂質(zhì)體混合。具體操作過(guò)程如下，轉(zhuǎn)染液A制備：將4 μg質(zhì)粒加到100 μL無(wú)菌、無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)液中，并輕輕混勻。轉(zhuǎn)染液B制備：將10 μL脂質(zhì)體Lipofectamine2000 與100 μL無(wú)菌、無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)液混勻，室溫放置5 min。隨后將A液與B液混合，37 ℃孵育20 min，最后加入2 μL 4%臺(tái)盼藍(lán)混勻，即可用于注射。

1.2.4睪丸輸出小管的注射麻醉小鼠，注射時(shí)濃度一般為1%，腹腔注射。小鼠昏迷后，固定四肢于木板上，置于體視顯微鏡下。開(kāi)腹：逐層打開(kāi)腹腔，表皮至肌層。將睪丸拉出腹腔：于膀胱旁邊尋找與睪丸相連的脂肪墊，輕輕拖出腹腔，小鼠的睪丸和附睪順勢(shì)被拖出腹腔。調(diào)節(jié)光源的亮度及顯微鏡放大倍數(shù)。用尖頭鑷找出輸出小管（圖1），并調(diào)整木板角度，使小鼠輸出小管的方向大約與玻璃針?lè)较蚱叫小ｋp手操作，夾起輸出小管，將其中一段套入玻璃針頭部，并順勢(shì)平行將輸出管向玻璃針?lè)较蛞苿?dòng)。左手固定輸出小管位置，右手推動(dòng)注射器，將轉(zhuǎn)染液和臺(tái)盼藍(lán)的混合液慢慢注射進(jìn)輸出小管內(nèi)。然后看到藍(lán)色的液體順著曲精細(xì)管的走向慢慢的充滿大部分曲精細(xì)管，使睪丸表面大部分曲精細(xì)管變藍(lán)。注射結(jié)束后，將睪丸放回腹腔，逐層關(guān)腹，縫合。最后將碘酒棉敷于小鼠腹部防止感染。注射后小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)。

1.2.5睪丸組織的石蠟切片 小鼠注射后，立即取一只小鼠將其睪丸做石蠟切片處理，觀察轉(zhuǎn)染液在曲細(xì)精管內(nèi)的分布情況，按文獻(xiàn)[7]里組織石蠟切片的方法進(jìn)行。

1.2.6睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)小鼠注射單獨(dú)飼養(yǎng)1周后，取一只小鼠的睪丸進(jìn)行睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)，觀察是否有熒光產(chǎn)生。按文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。

1.2.7睪丸組織曲細(xì)精管DNA提取注射后小鼠單籠飼養(yǎng)4周后提取剩余4只小鼠睪丸組織曲細(xì)精管DNA，按提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.8轉(zhuǎn)基因仔鼠的檢測(cè)利用Primer5軟件設(shè)計(jì)EGFP上、下游引物。上游引物序列為：5’-CAGCAGTCTTCCAACCCAAT-3’，下游引物序列為5’-TGAGAGGCGCACAGAACATC -3 '。PCR 產(chǎn)物為314 bp。PCR反應(yīng)體系包括：Taq DNA Polyrases （ 5 U·μL-1） 0.5 μL、10×Buffer 5 μL、dNTP（ 各2.5 mmol·L-1） 4 μl、引物Ⅰ、Ⅱ（ 25 pmol·μL-1）各1 μL、pEGFP-C1（ 500～1000 ng·μL-1） 1 μL 、dd H2O 37.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，33個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳。

2結(jié)果與分析

2.1睪丸輸出管注射后轉(zhuǎn)染液在睪丸內(nèi)的情況

轉(zhuǎn)染液在曲細(xì)精管中的流動(dòng)規(guī)律及分布：注射前期睪丸內(nèi)壓相對(duì)較小，只需輕微用力便可使轉(zhuǎn)染液迅速地在曲細(xì)精管中流動(dòng)（圖2）。注射后期由于睪丸內(nèi)壓變大，盡管加大注射壓力，但轉(zhuǎn)染液在曲細(xì)精管中的流動(dòng)速度沒(méi)有太大變化。此時(shí)停止注射，一個(gè)睪丸大約需要注射80～100 μL轉(zhuǎn)染液，時(shí)間大約10～20 min。通過(guò)睪丸輸出管，可以使小鼠睪丸表面大約70%～80%的曲細(xì)精管充滿轉(zhuǎn)染液（圖3），并且離睪丸輸出管近的曲精細(xì)管轉(zhuǎn)染液的充盈程度明顯較遠(yuǎn)端高。

2.2睪丸組織石蠟切片觀察

睪丸組織經(jīng)石蠟切片后，在顯微鏡下觀察，曲細(xì)精管內(nèi)部完全被轉(zhuǎn)染液染為藍(lán)色（圖4），這表明轉(zhuǎn)染液已經(jīng)完全進(jìn)入曲細(xì)精管管腔內(nèi)，這樣就大大提高了pEGFP-C1整合到精原細(xì)胞的效率。

2.3睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)

支持細(xì)胞分離培養(yǎng)24 h后，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞（圖5、圖6），這表明pEGFP-C1已經(jīng)整合到睪丸支持細(xì)胞內(nèi)。

2.4 睪丸曲細(xì)精管的PCR鑒定

利用設(shè)計(jì)的引物，對(duì)4只睪丸曲細(xì)精管進(jìn)行PCR鑒定，都是PCR陽(yáng)性（圖7）。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采取的睪丸輸出小管注射法，除此方法外，目前報(bào)道的還有睪丸網(wǎng)注射法[9]。Ogawa等[10]報(bào)道了此兩種移植方法具有相似的移植效率， 各有優(yōu)缺點(diǎn)。睪丸網(wǎng)注射法不需要解剖游離輸出小管[11]，但是直接睪丸網(wǎng)注射會(huì)由于這些纖維結(jié)締組織的彈性， 加之睪丸網(wǎng)厚度不到0.2 mm， 很容易穿透睪丸網(wǎng)而導(dǎo)致細(xì)胞懸液滲漏到間質(zhì)， 而且一旦穿破則很難補(bǔ)救[12]。經(jīng)輸出小管注射的方式具有快速可靠、滲漏少的特點(diǎn)。

小鼠睪丸輸出小管處在睪丸血管蒂的一側(cè)，幾乎與睪丸血管蒂大動(dòng)脈平行，一端與睪丸相連，另一端與附睪聯(lián)系。在進(jìn)行睪丸輸出管注射時(shí)，應(yīng)將玻璃針的針尖與輸出管平行，針尖與輸出管的角度≤10°，針頭一旦插入輸出小管應(yīng)始終保持插入針的平衡，如不小心將注射針從輸出小管中脫出，要重新剝離一段輸出管再進(jìn)行注射。精原細(xì)胞通過(guò)分裂、生長(zhǎng)和發(fā)育最后成為初級(jí)精母細(xì)胞。然后初級(jí)精母細(xì)胞經(jīng)過(guò)兩次成熟分裂，變?yōu)榇渭?jí)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞[13]。精子細(xì)胞再經(jīng)過(guò)一些形態(tài)變化，最后變?yōu)榫印＞佑删杉?xì)胞成熟分化而來(lái)，精原干細(xì)胞在雄性動(dòng)物出生后，一直處于不斷分裂增殖的狀態(tài)[14]。將外源基因轉(zhuǎn)染到曲細(xì)精管內(nèi)的精原干細(xì)胞，使其整合到精原干細(xì)胞的染色體中，這樣，就有可能使干細(xì)胞不斷分化成熟的精子攜帶外源基因[15]。另外，小鼠睪丸支持細(xì)胞是曲細(xì)精管的上皮細(xì)胞，給精子的發(fā)生提供微環(huán)境，在精子發(fā)生中起重要的作用。本試驗(yàn)采用睪丸輸出管注射法將脂質(zhì)體包裹pEGFP-C1表達(dá)載體注射到曲細(xì)精管中，石蠟切片觀察到轉(zhuǎn)染液已經(jīng)完全進(jìn)入曲細(xì)精管內(nèi)，這樣便大大提高了外源基因整合到曲細(xì)精管的效率。又經(jīng)一周后分離培養(yǎng)睪丸的支持細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)睪丸的支持細(xì)胞有綠色熒光產(chǎn)生，說(shuō)明外源基因已經(jīng)整合到睪丸的支持細(xì)胞內(nèi)，而支持細(xì)胞對(duì)精子的發(fā)生具有重要的作用，這樣便會(huì)源源不斷地產(chǎn)生帶有外源基因的精子，從而達(dá)到轉(zhuǎn)基因的目的。后對(duì)其余4只小鼠的睪丸做了PCR檢測(cè)，均顯示為陽(yáng)性，說(shuō)明這幾只小鼠已經(jīng)構(gòu)建成為轉(zhuǎn)基因小鼠。

本試驗(yàn)采用睪丸輸出管注射法將外源基因?qū)肭?xì)精管中，而不是睪丸直接注射[16]或者打點(diǎn)注射[17]，通過(guò)一個(gè)體內(nèi)的轉(zhuǎn)基因過(guò)程使得精子攜帶外源基因，獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。過(guò)程簡(jiǎn)單，對(duì)于試驗(yàn)條件的要求相對(duì)低。更重要的是一旦精原細(xì)胞成功整合了外源基因，由于其自身的獨(dú)特生物學(xué)性質(zhì)，睪丸中便會(huì)源源不斷地產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)基因精子。試驗(yàn)對(duì)于大的家畜等動(dòng)物建立轉(zhuǎn)基因模型具有重要的指導(dǎo)意義。

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