苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ笮蜏新远拘院虶ST酶活性影響的研究

摘要：研究苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ笮蜏袃纱?4 d慢性毒性試驗(yàn)和子代恢復(fù)試驗(yàn)，觀測(cè)了大型溞的存活率、生長速度、產(chǎn)卵量、產(chǎn)卵時(shí)間等生物學(xué)指標(biāo)。并以苯醚甲環(huán)唑EC50濃度處理48 h，測(cè)定大型溞體內(nèi)GST酶活力與時(shí)間和劑量的效應(yīng)關(guān)系，探尋敏感性毒性指標(biāo)。結(jié)果表明，苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ笮蜏械漠a(chǎn)卵時(shí)間、產(chǎn)卵量以及卵的孵化有明顯的抑制作用，子代恢復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)存活下來的后代雖有一定的恢復(fù)，但是較高濃度處理組的一些敏感指標(biāo)如產(chǎn)卵量、產(chǎn)卵時(shí)間等與對(duì)照組相比差異顯著。苯醚甲環(huán)唑?qū)ST酶活性影響隨處理時(shí)間的延長和濃度的提高而逐漸增強(qiáng)，處理48 h后酶活力達(dá)到最高值。當(dāng)苯醚甲環(huán)唑濃度為1.00 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率最大，達(dá)到324.84%，試驗(yàn)結(jié)果表明GST酶可以作為苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ笮蜏卸拘杂绊懙纳飿?biāo)志物。

關(guān)鍵詞：苯醚甲環(huán)唑；大型溞；慢性毒性；GST酶

中圖分類號(hào)：TQ450.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）01-0079-05

自2007年瑞士先正達(dá)首家登記300 g/L苯醚甲·丙環(huán)唑乳油防治水稻紋枯病并取得良好防效以來，國內(nèi)外對(duì)苯醚甲環(huán)唑和丙環(huán)唑的登記日趨旺盛。苯醚甲環(huán)唑（Difenoconazole）是一種內(nèi)吸廣譜型唑類殺菌劑，對(duì)多種蔬菜和果樹的葉斑病、白粉病、銹病及黑星病等病害有較好的治療效果。國內(nèi)外有關(guān)殺菌劑對(duì)大型溞慢性毒性的研究很少，而且國內(nèi)外文獻(xiàn)未見有關(guān)苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ笮蜏新远拘约皩?duì)GST酶活性影響的研究報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)生物

大型溞系從農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所生測(cè)中心引種的62 D.M純品系生物株，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)3代以上。一周更換2～3次培養(yǎng)液，每天喂食斜生柵藻，投餌密度為每1 mL含2.0×105～3.0×105個(gè)藻類細(xì)胞，飼養(yǎng)密度為每50 mL培養(yǎng)液1只母蚤。挑選出生6～24 h健康活潑的幼溞用于毒性試驗(yàn)[1]。

1.2 供試藥劑

苯醚甲環(huán)唑97%原藥，用分析純丙酮配成一定濃度的儲(chǔ)備液，放置0～4 ℃冰箱保存。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 慢性毒性試驗(yàn) 14 d慢性毒性試驗(yàn)參考OECD標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[2]。苯醚甲環(huán)唑難溶于水而溶于丙酮。試驗(yàn)濃度設(shè)置以急性48 h-EC50和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組、一個(gè)丙酮最大濃度對(duì)照組和5個(gè)苯醚甲環(huán)唑濃度組。苯醚甲環(huán)唑濃度依次為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/L，每個(gè)濃度設(shè)置10個(gè)平行組。每個(gè)燒杯中盛放40 mL試驗(yàn)溶液，試驗(yàn)每個(gè)重復(fù)中只加2只大型溞，每個(gè)燒杯中放2只幼溞。試驗(yàn)期間采用半靜態(tài)試驗(yàn)系統(tǒng)，用新鮮的柵藻（2.0×105～3.0×105個(gè)cells/mL ）喂養(yǎng)大型溞。48 h更換一次試驗(yàn)溶液，保證試驗(yàn)期間藥劑濃度為起始濃度的80%以上。

1.3.2 子代14 d恢復(fù)試驗(yàn) 分別選取每個(gè)試驗(yàn)處理組中母溞所生的第一胎幼溞F1（lst）和第三胎幼溞F1（3rd）各20只（小于24 h），分別放在40 mL的培養(yǎng)液中（恢復(fù)期），進(jìn)行14 d的恢復(fù)培養(yǎng)，其他條件與慢性毒性試驗(yàn)相同。試驗(yàn)期間每24 h觀察1次，取出新生幼溞，紀(jì)錄母溞第一次產(chǎn)卵時(shí)間、第一次產(chǎn)卵數(shù)、第三次產(chǎn)卵時(shí)間、第三次產(chǎn)卵數(shù)以及整個(gè)試驗(yàn)過程中的產(chǎn)卵次數(shù)、總產(chǎn)卵數(shù)、母溞脫皮次數(shù)等，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)在顯微鏡下測(cè)量其體長（從頭盔至殼刺部的長度）。

1.3.3 苯醚甲環(huán)唑?qū)ST酶活性影響試驗(yàn)

1）暴露試驗(yàn)。試驗(yàn)所選大型溞為出生小于24 h的健康活潑的幼溞，試驗(yàn)方法參考OECD標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法[2]進(jìn)行。

2）酶源制備。 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）的配制，即準(zhǔn)確稱取0.605 7 g Tris堿，用去離子水溶解，配成50 mL 0.1 mol/L的Tris溶液，加29.2 mL 0.1 mol/L的HCl，用去離子水定容至100 mL，密封保存，試驗(yàn)所需全部溶液預(yù)冷至0 ℃。取出健康大型溞至少80只置于玻璃勻漿器中，加入0.8 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）勻漿，在12 000 r/min、4 ℃條件下離心30 min，取上清液，一部分進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定，另一部分進(jìn)行GST酶活力測(cè)定。

1.3.4 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 采用Bradford考馬斯亮藍(lán)G-250法[3]。

1.3.5 GST酶活性測(cè)定 參照文獻(xiàn)[4]的方法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

慢性毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行顯著性分析[5]，比較對(duì)照組和藥劑處理組之間的區(qū)別。對(duì)GST酶活性影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 12.0軟件進(jìn)行處理，將不同濃度酶活力的測(cè)定結(jié)果與對(duì)照組進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ笮蜏?4 d慢性毒性 苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ笮蜏械?4 h和48 h急性毒性試驗(yàn)的EC50分別為1.19 mg/L和0.52 mg/L。苯醚甲環(huán)唑（亞致死劑量）對(duì)大型溞F0代母溞的存活、生長以及繁殖等影響情況見表1。苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ笮蜏新远拘栽囼?yàn)中最高無影響濃度（NOEC）和最低有影響濃度（LOEC）數(shù)值見表2。

慢性毒性試驗(yàn)期間，對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)冬卵現(xiàn)象。由表1分析可知，大型溞第一次產(chǎn)卵時(shí)間和產(chǎn)卵數(shù)、第三次產(chǎn)卵時(shí)間和產(chǎn)卵數(shù)以及整個(gè)試驗(yàn)過程中的產(chǎn)卵次數(shù)、總產(chǎn)卵數(shù)、母溞脫皮次數(shù)、體長以及存活情況等各項(xiàng)指標(biāo)都受到了不同程度的影響。現(xiàn)將結(jié)果分析如下：①脫皮：苯醚甲環(huán)唑濃度在0.05 mg/L以上對(duì)大型溞的脫皮有顯著影響（P<0.05）；②產(chǎn)卵：濃度在0.10 mg/L以上時(shí)第一次產(chǎn)卵時(shí)間明顯延后，并且當(dāng)濃度達(dá)到0.25 mg/L時(shí)大型溞的產(chǎn)卵明顯受抑制；當(dāng)濃度大于0.15 mg/L時(shí)不會(huì)再產(chǎn)生第三胎卵；濃度在0.05 mg/L時(shí)產(chǎn)卵總量和母溞產(chǎn)卵胎數(shù)較對(duì)照組（包括空白組和丙酮組）明顯減少，同時(shí)部分母蚤開始產(chǎn)不能孵化的卵，即死卵，而且隨著藥劑濃度的升高，產(chǎn)死卵的時(shí)間開始提前，死卵的個(gè)數(shù)也隨之增加；③體長：藥劑處理組大型溞母體長與對(duì)照組相比差異顯著，并且隨著濃度的變化處理組之間差異明顯。

由表2可知，大型溞的各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性不同，其敏感性從高到低依次為幼溞數(shù)/2只母溞、第三次產(chǎn)卵數(shù)、胎數(shù)/2只母溞、第一次產(chǎn)卵時(shí)間、第一次產(chǎn)卵數(shù)、脫皮次數(shù)/2只母溞、體長。對(duì)于苯醚甲環(huán)唑來說，最敏感的指標(biāo)是母溞產(chǎn)幼溞的數(shù)量，苯醚甲環(huán)唑亞致死效應(yīng)對(duì)大型溞的后代有明顯的抑制作用，這與慢性毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)的結(jié)果相一致。

2.1.2 14 d子代恢復(fù)情況 苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ笮蜏凶饔煤驠1（1st）和F1（3rd）14 d恢復(fù)試驗(yàn)，第一胎（F1（1st））和第三胎（F1（3rd））恢復(fù)試驗(yàn)結(jié)果見表3和表4。由表3中數(shù)據(jù)的顯著性分析結(jié)果可知，子代F1（1st）在恢復(fù)試驗(yàn)中，丙酮對(duì)照組空白對(duì)照組之間有些指標(biāo)有一定的差異，這可能與試驗(yàn)條件或試驗(yàn)操作有關(guān)，也可能是以丙酮做溶劑時(shí)，丙酮對(duì)大型溞子代有一定的影響，對(duì)此可以設(shè)定一個(gè)丙酮系列濃度做進(jìn)一步研究。處理組子代 F1（1st）存活下來的個(gè)體與對(duì)照組相比均有差異，并且隨著苯醚甲環(huán)唑濃度的提高差異愈顯著。子代 F1（3rd）存活的后代處理組與對(duì)照組仍有一定的顯著性差異。但是與母代F0代相比這些指標(biāo)差異有所減小，即子代相對(duì)母代有所恢復(fù)。第一胎（F1（1st））和第三胎（F1（3rd））恢復(fù)試驗(yàn)中，未發(fā)現(xiàn)死亡溞、雄溞和冬卵現(xiàn)象。

2.2 苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ笮蜏畜w內(nèi)GST酶的影響

2.2.1 不同處理時(shí)間苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ笮蜏畜w內(nèi)GST酶活性的誘導(dǎo) 試驗(yàn)測(cè)定了苯醚甲環(huán)唑濃度為0.52 mg/L時(shí)，藥劑處理后1、2、4、8、16、24、48 h時(shí)大型溞體內(nèi)GST酶的活性隨時(shí)間的變化情況，結(jié)果如圖1所示。

試驗(yàn)結(jié)果表明，濃度為0.52 mg/L（48 h EC50值）時(shí)，48 h內(nèi)大型溞體內(nèi)的GST酶活力的變化如圖1所示，其中系列1為空白對(duì)照，系列2為丙酮對(duì)照，系列3為藥劑處理組。短時(shí)間內(nèi)（苯醚甲環(huán)唑處理后1～8 h）藥劑處理組與對(duì)照組之間沒有顯著性差異，隨著處理時(shí)間的延長，藥劑處理組GST酶的活力顯著高于對(duì)照組（包括空白組和丙酮組），即GST酶活力被顯著激活。而且48 h內(nèi)隨著處理時(shí)間的延長，處理組GST酶活力與對(duì)照組相比差異越來越顯著。處理48 h時(shí)GST酶的活力達(dá)到最高值。

2.2.2 GST酶活力與濃度的劑量-效應(yīng)關(guān)系 該部分試驗(yàn)測(cè)定了苯醚甲環(huán)唑濃度為0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L時(shí)，處理48 h大型溞體內(nèi)GST酶活力的變化情況，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，不同濃度的苯醚甲環(huán)唑處理組之間（除0.40 mg/L和0.60 mg/L之間沒有顯著差異外）GST酶活力存在顯著性差異，與對(duì)照組相比，處理組GST酶均被誘導(dǎo)。并且隨著藥劑濃度的升高，GST酶活性被誘導(dǎo)的幅度提高，當(dāng)苯醚甲環(huán)唑濃度為1.00 mg/L時(shí)酶活力達(dá)到最大，誘導(dǎo)率為324.84%。

3 討論

苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ笮蜏械拇婊钜约奥训姆趸⒑蟠苫钣幸欢ǖ挠绊懀⑶译S著藥劑濃度的提高影響程度逐漸增大。濃度較高的藥劑嚴(yán)重影響了母代（F0）大型溞的產(chǎn)卵，包括產(chǎn)卵時(shí)間、產(chǎn)卵量以及后代的存活，濃度大于0.10 mg/L時(shí)沒有成功孵化的幼溞。試驗(yàn)所測(cè)定的指標(biāo)中，第一次產(chǎn)卵時(shí)間與對(duì)照組相比較延長了0.50 d左右，產(chǎn)卵次數(shù)至少減少2.7次。水溞蛻皮次數(shù)明顯減少，齡期減少，齡期之間的間隔延長，導(dǎo)致大型溞生長緩慢，14 d內(nèi)的產(chǎn)卵總數(shù)大大減少。由此可見，大型溞的生物學(xué)參數(shù)之間是相互影響相互關(guān)聯(lián)的。

藥劑對(duì)大型溞的產(chǎn)卵量及卵的孵化有明顯的影響，隨著濃度的升高和時(shí)間的延長，影響也越來越顯著，尤其是對(duì)卵的孵化的影響，由于試驗(yàn)開始時(shí)未預(yù)測(cè)到該項(xiàng)指標(biāo)，沒有將該指標(biāo)納入觀測(cè)指標(biāo)之列，加之卵出現(xiàn)的時(shí)間短、個(gè)體小，沒有引起足夠重視，以至于開始時(shí)沒有記錄開始出現(xiàn)的未孵化卵的個(gè)數(shù)，但可以明顯觀察到隨著濃度的升高和時(shí)間的延長，卵的數(shù)量明顯減少，對(duì)此可以做進(jìn)一步研究。

苯醚甲環(huán)唑?qū)1（1st）和F1（3rd）代母溞恢復(fù)試驗(yàn)中，子代母溞的蛻皮、產(chǎn)卵和體長等各項(xiàng)指標(biāo)較F0代均有所恢復(fù)，可見在成卵期受到污染的水溞被轉(zhuǎn)移到無污染的生存環(huán)境中時(shí)，可將體內(nèi)的污染物代謝降解或排出體外[6]，但恢復(fù)不太徹底，子代的各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組相比仍有一定的差異，且子代F1（3rd）存活的后代各指標(biāo)的恢復(fù)狀況較F1（1st）代差，這可能與試驗(yàn)濃度設(shè)置過高有關(guān)，但也說明較高濃度的農(nóng)藥由于水溞母體富集在體內(nèi)并通過卵轉(zhuǎn)移到子代體內(nèi)，使其子代水溞恢復(fù)起來比較緩慢，并且隨著苯醚甲環(huán)唑作用時(shí)間的延長，其對(duì)子代的影響越嚴(yán)重，恢復(fù)越慢，進(jìn)而影響水溞種群的發(fā)展。

在苯醚甲環(huán)唑不同作用時(shí)間下，水溞GST酶的活力隨著時(shí)間的延長呈被誘導(dǎo)上升的趨勢(shì)；不同濃度苯醚甲環(huán)唑作用下，GST酶的活性隨濃度的升高也呈上升趨勢(shì)。在較多的研究中，某些海區(qū)污染會(huì)造成水產(chǎn)動(dòng)物GST酶活力的升高[7-9]，有人發(fā)現(xiàn)在高程度污染的情況下，GST酶活力會(huì)降低[10]。從本試驗(yàn)的研究結(jié)果看，不同濃度的苯醚甲環(huán)唑處理大型溞48 h后，GST酶的活力被顯著激活，說明大型溞在本試驗(yàn)測(cè)定的濃度范圍內(nèi)提高了體內(nèi)GST酶的活力以加強(qiáng)GSH與毒物的結(jié)合能力；由于本試驗(yàn)中GST酶活力在不同時(shí)間和不同濃度作用下都表現(xiàn)出一定的誘導(dǎo)、激活和抑制，初步建立了苯醚甲環(huán)唑與大型溞體內(nèi)GST酶活性的時(shí)間—效應(yīng)關(guān)系和劑量—效應(yīng)關(guān)系，反映了有毒物質(zhì)對(duì)大型溞的致毒程度和大型溞的解毒過程，可以將GST活力作為苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ笮蜏杏绊懙纳飿?biāo)志物。

5 結(jié)論

各項(xiàng)指標(biāo)的敏感性從高到低順序?yàn)橛诇袛?shù)/2只母蚤、第三次產(chǎn)卵數(shù)、胎數(shù)/2只母溞、第一次產(chǎn)卵時(shí)間、第一次產(chǎn)卵數(shù)、脫皮次數(shù)/2只母溞、體長；另外，由于藥劑的長時(shí)間作用和藥劑濃度的積累，大型溞的體長、產(chǎn)卵及后代存活等指標(biāo)受到的影響越來越嚴(yán)重，可見田間如果長時(shí)間連續(xù)用藥，藥劑積累，就會(huì)影響大型溞的種群發(fā)展，進(jìn)而影響整個(gè)水生環(huán)境，建議環(huán)境水域中苯醚甲環(huán)唑的濃度以不超過0.05 mg/L為宜。另外，由于三唑類藥劑的代謝產(chǎn)物復(fù)雜，后續(xù)研究可以結(jié)合色譜分析等方法檢測(cè)試驗(yàn)后期試驗(yàn)大型溞生活的水體中主要的化學(xué)成分以及各自的含量，以確定其影響大型溞繁殖和卵孵化的深層次原因。

本研究對(duì)大型溞體內(nèi)GST酶活性的測(cè)定采用的離體試驗(yàn)方法切實(shí)可行、易于操作。通過對(duì)大型溞的體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)，苯醚甲環(huán)唑?qū)ST酶活性產(chǎn)生明顯的誘導(dǎo)作用，其結(jié)果與對(duì)照組相比差異顯著。由此表明GST的酶活性誘導(dǎo)可作為生物標(biāo)志物來研究苯醚甲環(huán)唑的生態(tài)毒理效應(yīng)，為研究三唑類殺菌劑對(duì)水體環(huán)境的潛在危害性提供了一種新的思路。

另外，因?yàn)橛绊懮矬w內(nèi)GST酶活性的因素很多，如環(huán)境酸堿度、溫度、生物體的齡期以及受試生物體的敏感程度，若單獨(dú)使用某一種生化指標(biāo)很可能會(huì)導(dǎo)致評(píng)價(jià)結(jié)果與現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際污染狀況的偏離，如果能同時(shí)使用幾種不同的生化指標(biāo)，并結(jié)合以上慢性毒理學(xué)測(cè)定數(shù)據(jù)，其評(píng)價(jià)結(jié)果更能如實(shí)地反映現(xiàn)場(chǎng)的真實(shí)污染狀況。

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