SSR鑒定水稻兩系雜交種純度的運(yùn)用與探討 Ⅵ.不同引物判定同一樣品植株純度的準(zhǔn)確性

摘要：將同一樣品在室內(nèi)用不同引物對(duì)各植株進(jìn)行檢測(cè)，并與田間檢測(cè)結(jié)果比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同方法對(duì)雜株的判別能力不同，并分析了導(dǎo)致同一植株出現(xiàn)不同判定結(jié)果的原因，為降低分子檢測(cè)和田間鑒定結(jié)果之間的誤差提出了相應(yīng)技術(shù)對(duì)策。

關(guān)鍵詞：兩系雜交稻；SSR；不同引物；同一樣品植株；純度鑒定；準(zhǔn)確性

中圖分類號(hào)：Q789；S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）01-0019-03

利用SSR分子標(biāo)記鑒定兩系雜交稻種子純度具有快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好、多態(tài)性高的優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)在室內(nèi)鑒定種子純度應(yīng)用最為廣泛的分子標(biāo)記方法。該方法一般是從大量的引物中篩選出多態(tài)性高、共顯性強(qiáng)、雙親譜帶清晰的1對(duì)引物來(lái)鑒定雜交稻種子的純度[1-5]。在實(shí)驗(yàn)操作中，篩選出的引物往往不止一種[6，7]，這些引物對(duì)同一品種都具有多態(tài)性，且都符合引物篩選的標(biāo)準(zhǔn)。就意味著多對(duì)引物都可用于同一品種的純度鑒定，這為引物篩選和品種鑒定提供了方便。但就完全相同的一份樣品而言，不同引物對(duì)雜株類型及雜株數(shù)量的識(shí)別能力是否一致很少見(jiàn)諸報(bào)道[8-12]。本研究的目的在于探討同一樣品的各植株分別用3～4對(duì)不同的引物檢測(cè)，并與田間檢出的雜株比對(duì)，比較不同引物對(duì)雜株識(shí)別能力的差異，分析誤差產(chǎn)生的原因并提出相應(yīng)對(duì)策。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用雜交稻苯兩優(yōu)639、天兩優(yōu)616、兩優(yōu)17及其親本均由湖北省種子管理局提供。2010年已做過(guò)田間正季鑒定，分別代表全省當(dāng)年種子純度高、中、低3個(gè)類型的樣本群體。所用引物及試劑均由北京鼎國(guó)生物有限公司提供。

1.2 PCR反應(yīng)體系

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積10 μL：10×Buffer 1 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，50 ng/μL引物0.2 μL+0.2 μL，2 U/μL Taq DNA聚合酶 0.6 μL，25 ng/μL DNA 1 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃下延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在濃度為3%、含EB的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄。

1.3 DNA模板制備和引物篩選

DNA模板的制備采用農(nóng)業(yè)部推薦的簡(jiǎn)易法分別提取各單株的DNA。引物的篩選見(jiàn)文獻(xiàn)[13]，即從農(nóng)業(yè)部推薦的用于純度鑒定的44對(duì)SSR多態(tài)性引物中篩選出適合于上述品種的3～4對(duì)最佳引物進(jìn)行分子鑒定（表1）。

1.4 田間種植情況及純度鑒定

3個(gè)試驗(yàn)品種都進(jìn)行了田間正季鑒定，于2011年4月15日播種，5月15日移栽。每品種田間種植1個(gè)小區(qū)，每小區(qū)500株，共50行，每行10株，行距26.7 cm，株距16.7 cm。在抽穗前及齊穗后分兩次按GB/T 3543.5—1995進(jìn)行田間純度鑒定，并觀察比較各品種間的植物學(xué)形態(tài)特征和生物學(xué)特性。

1.5 純度結(jié)果比對(duì)

秧苗移栽20 d后，在田間按植株編號(hào)逐株剪取其倒數(shù)第二葉，用表1中篩選的3～4對(duì)引物檢測(cè)。將室內(nèi)鑒定的雜株與田間雜株進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，再將室內(nèi)鑒定出的雜株和田間鑒定的所有雜株取樣，回室內(nèi)再次鑒定。通過(guò)反復(fù)比對(duì)室內(nèi)和田間的雜株類型，判斷SSR分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與一致性。

2 結(jié)果與分析

兩優(yōu)17有效鑒定株數(shù)495株，用4對(duì)引物進(jìn)行室內(nèi)鑒定并根據(jù)植物學(xué)形態(tài)特征和生物學(xué)特性進(jìn)行田間鑒定，共檢出88株雜株。其中，田間鑒定檢出7種類型，共48株雜株；分子檢測(cè)時(shí)RM212檢出雜株52株，RM17和RM1各檢出雜株55株， RM21檢出雜株72株。苯兩優(yōu)639有效鑒定株數(shù)344株，田間鑒定出雜株7株，分子檢測(cè)時(shí)RM263檢出雜株4株，RM17和RM208各檢出雜株6株。天兩優(yōu)616有效鑒定株數(shù)316株，田間鑒定出雜株17株，分子檢測(cè)時(shí)RM263檢出雜株7株，RM17檢出雜株12株，M5檢出雜株13株，RM243檢出雜株14株。就同一植株而言，田間和室內(nèi)判斷結(jié)果存在差異，不同引物之間的判斷結(jié)果也不盡相同，主要表現(xiàn)為以下幾個(gè)方面。

2.1 不育系和恢復(fù)系的雜株均能被各引物準(zhǔn)確檢出

兩優(yōu)17田間鑒定出恢復(fù)系有3株，不育株有9株，在室內(nèi)檢測(cè)中，這些雜株都能夠被4對(duì)引物檢出，并表現(xiàn)為典型的兩優(yōu)17恢復(fù)系和不育系譜帶；苯兩優(yōu)639田間鑒定出不育株有2株，在室內(nèi)檢測(cè)中，這些雜株都能夠被3對(duì)引物檢出，并表現(xiàn)為典型的苯兩優(yōu)639不育系譜帶；天兩優(yōu)616田間鑒定出不育株有3株，在室內(nèi)檢測(cè)中，這些雜株都能夠被4對(duì)引物檢出，并表現(xiàn)為典型的天兩優(yōu)616不育系譜帶。

以上結(jié)果表明，用親本或雜交種篩選的引物能夠準(zhǔn)確分辨出混入受檢樣品的親本及類型。如果受檢樣品中混入的雜株全部是本品種的不育系和恢復(fù)系，用SSR引物檢測(cè)的純度結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。

2.2 部分田間異形株被多種引物一致判定為正常株

在3個(gè)參試材料的檢測(cè)中均存在不同程度的田間雜株被SSR引物漏檢的現(xiàn)象，即同一株樣品，田間判定是雜株，室內(nèi)判定為本品種正常株。

兩優(yōu)17田間鑒定出的48株雜株中，有5株典型異形株被所用的全部SSR引物漏檢，其中4株為典型的遲熟變異品種，1株為典型的早熟、矮稈、團(tuán)粒形雜株。苯兩優(yōu)639田間鑒定出的7株雜株中，有1株典型矮稈、遲熟雜株被所用的全部SSR引物漏檢。天兩優(yōu)616田間鑒定出的17株雜株中，有1株典型異形株被所用的全部SSR引物漏檢。這一結(jié)果是因?yàn)檫@類雜株的DNA分子上存在與受檢品種正常株相同的DNA片段，所以復(fù)制、擴(kuò)增后的電泳譜帶與正常株相同，無(wú)法被檢出。

2.3 部分田間表現(xiàn)為正常株的植株被多種引物一致判為不育系或恢復(fù)系

在田間鑒定中發(fā)現(xiàn)，有些植株的特征特性和原品種的正常株表現(xiàn)相同，按田間標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)判斷為正常株。但在室內(nèi)鑒定時(shí)，其帶型在所用全部引物檢測(cè)中，均為不育系或恢復(fù)系的帶型，應(yīng)判定為雜株。例如樣品兩優(yōu)17中有6株田間表現(xiàn)為正常株，室內(nèi)檢測(cè)為不育株的譜帶；有4株田間表現(xiàn)為正常株，室內(nèi)檢測(cè)為恢復(fù)系的譜帶。

2.4 田間同一異形株用不同的引物檢出的譜帶特征不同

室內(nèi)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，同一植株用不同的引物檢測(cè)時(shí)，有的引物表現(xiàn)為恢復(fù)系的譜帶特征，有的引物表現(xiàn)為不育系的譜帶特征。例如樣品兩優(yōu)17中有6株被不同引物檢測(cè)時(shí)表現(xiàn)為不同的譜帶特征，其中2株田間表現(xiàn)為團(tuán)粒形的秈型常規(guī)早稻，室內(nèi)檢測(cè)時(shí)，RM17判定為不育系，其余3對(duì)引物均判定為恢復(fù)系；其中1株田間表現(xiàn)為其他品種，室內(nèi)檢測(cè)時(shí)，RM17判定為恢復(fù)系，其余3對(duì)引物均判定為不育系；其中1株田間表現(xiàn)為正常株，室內(nèi)檢測(cè)時(shí)，RM17判定為恢復(fù)系，其余3對(duì)引物均判定為不育系。樣品天兩優(yōu)616中有1株田間表現(xiàn)為早熟、矮稈、粒型小、褐色穎殼，為典型的異形株，室內(nèi)檢測(cè)時(shí)，引物RM5和RM243判定為恢復(fù)系，RM263和RM17判定為不育系。這反映出同一品種DNA片段的多樣性和復(fù)雜性。

2.5 部分異形株有的引物能檢出，有的引物則不能檢出

在檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，同一植株用不同的引物檢測(cè)時(shí)，有的引物將其判定為正常株，而有的則將其判定為雜株。例如兩優(yōu)17中這樣的植株有52株，占總雜株數(shù)的59.1%；苯兩優(yōu)639中這樣的植株有3株，占總雜株數(shù)的42.9%；天兩優(yōu)616中這樣的植株有11株，占總雜株數(shù)的64.7%。

這表明雜株DNA上是否存在與某種引物所擴(kuò)增的SSR片段相同的片段，決定了它是否被該種引物檢出。這一方面說(shuō)明引物對(duì)樣品中雜株DNA的針對(duì)性是引物選用中應(yīng)該關(guān)注的問(wèn)題；另一方面也說(shuō)明樣品質(zhì)量背景復(fù)雜時(shí)，單對(duì)引物檢測(cè)種子純度存在風(fēng)險(xiǎn)。

2.6 部分田間表現(xiàn)正常的植株，室內(nèi)檢測(cè)為雜株

兩優(yōu)17的鑒定田中，有42株植株特征特性與正常株相同，按田間鑒定標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)判定為正常株。室內(nèi)SSR引物檢測(cè)時(shí)，這些植株被所用全部或部分引物判定為雜株，占總雜株數(shù)的47.7%。這反映了田間鑒定與DNA分子水平鑒定種子純度在原理、方法和判定依據(jù)等方面存在差別。

3 小結(jié)與討論

通過(guò)本次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有許多問(wèn)題值得進(jìn)一步研究和探討。

3.1 不能按照譜帶特征判斷雜株類型

所檢出的各品種DNA譜帶上只表現(xiàn)父本、母本及其互補(bǔ)型3種帶型，但田間卻發(fā)現(xiàn)了多種形態(tài)的雜株類型。因此，室內(nèi)DNA譜帶與田間雜株類型之間不存在一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。

3.2 SSR引物之間雜株辨別率差距較大

對(duì)同一雜株而言，不同引物的判斷可能有對(duì)有錯(cuò)，而且相互間的差異較大。在兩優(yōu)17中，雜株識(shí)別率最高的引物是RM21（81.8%），最低的是RM212（59.1%）。

3.3 單對(duì)SSR引物檢測(cè)雜株類型構(gòu)成復(fù)雜的樣品時(shí)可靠性較低

從以上試驗(yàn)可看出，當(dāng)品種中雜株類型主要為不育系和恢復(fù)系時(shí)，單對(duì)引物判定雜株的準(zhǔn)確性較高。隨著雜株類型的增加，單對(duì)引物對(duì)雜株的判斷力下降，純度誤差增大。

單對(duì)引物檢測(cè)兩系雜交稻種子純度的方法具有高效、節(jié)本、結(jié)果穩(wěn)定且重現(xiàn)性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，其理論基礎(chǔ)和操作技術(shù)也日趨成熟。通過(guò)上述試驗(yàn)表明，該技術(shù)上升為行業(yè)或國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)還存在一些問(wèn)題需要完善和明確，應(yīng)用該技術(shù)時(shí)須設(shè)計(jì)一些必要的前置條件，主要表現(xiàn)在：一是引物的選用上要關(guān)注引物對(duì)不同雜株類型的針對(duì)性和識(shí)別力。因此，育種單位和種子生產(chǎn)企業(yè)在建立品種基因圖譜的基礎(chǔ)上應(yīng)篩選出具有針對(duì)性的引物供檢測(cè)時(shí)選用；二是樣品DNA采集時(shí)應(yīng)考慮將不能成秧的弱苗、殘苗剔出，以降低室內(nèi)純度與田間純度之間的系統(tǒng)誤差；三是盡可能了解受檢樣品的生產(chǎn)背景和雜株類型，對(duì)那些親本不純、隔離條件不好、機(jī)械混雜嚴(yán)重的樣品，可選用多對(duì)不同引物對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，并同時(shí)進(jìn)行田間正季鑒定。

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