殼聚糖、海藻酸鈉、百里香酚及其復合物對靈武長棗采后主要病原真菌的抑制作用

摘要：研究了殼聚糖、海藻酸鈉、百里香酚及其復合物對靈武長棗（Zizphus jujube Mill cv. Lingwu changzao）采后主要病原真菌黑根霉、皮落青霉、鏈格孢、粉紅聚端孢的抑菌效應，并確定其最低抑菌濃度。結果表明，3種抑菌劑及其復合物對4種供試菌均有不同程度的抑制作用；其對4種供試菌的最低抑菌濃度由小到大為殼-百復合物、海-百復合物、百里香酚、殼聚糖、海藻酸鈉，復合物的抑菌效應比含有相同有效濃度的單體抑菌效應有明顯提高。

關鍵詞：靈武長棗（Zizphus jujube Mill cv. Lingwu changzao）；病原真菌；抑菌作用；殼聚糖；海藻酸鈉；百里香酚

中靈武長棗（Zizphus jujube Mill cv. Lingwu changzao）鼠李科棗屬植物，中國獨有，寧夏特產[1]，至今栽培有300多年的歷史[2]，是寧夏靈武地區的特色優良果品。其個大、色艷、果肉致密酥脆、酸甜適口、營養豐富，是集營養、保健于一體的優質果品。但靈武長棗與其他棗類一樣，在自然條件下貯藏比較困難，鮮銷期只有半個月左右[3]，究其原因主要是在貯藏中真菌病害浸染而導致腐爛，腐爛率可達30%～40%[3]。長期以來人們大多采用低溫貯藏、氣調貯藏等措施配合使用保鮮劑、涂膜劑等來防治靈武長棗貯藏中的腐爛[4-10]。近年來， 利用可食性的、環保的天然抑菌劑來防治靈武長棗采后的病害已成為一種趨勢，甘瑾等[3]用高良姜、桑葉、連翹等22種植物提取液對靈武長棗致病菌進行了體外抑菌效果的研究；任玉鋒等[11]進行了生姜汁、大蒜汁中有效成分對靈武長棗采后主要病原真菌鏈格孢、粉紅聚端孢、皮落青霉、黑根霉的抑制效果的研究。

殼聚糖是甲殼素經脫乙酰基反應得到的天然、無毒的高聚物，近年來大量研究表明其在果蔬保鮮和植物保護中具有較好的抗菌效果[12]。海藻酸鈉（ALG）又稱海藻膠、褐藻酸鈉或海帶膠，是褐藻類中提取的天然多糖類化合物[13]。海藻酸鹽能在pH值較低時（即酸性介質環境下）與水或多價離子（如鈣離子等）產生凝膠，在工業、食品生產中常被用作凝膠基質、增稠劑、穩定劑、膜材、水性阻滯劑等，且對靈武長棗具有一定的保鮮效果[10]。百里香酚（5-甲基-2-異丙基酚）又名麝香草酚，存在于多種植物的精油中，具有較強的抑菌作用[14]。有研究表明，殼聚糖和具有抑菌活性的百里香酚復合物對細菌具有增效協同作用[15]。然而，殼聚糖和百里香酚、海藻酸鈉和百里香酚復合物對果蔬采后主要病原真菌抑制效應卻鮮有報道。本試驗主要研究殼聚糖、海藻酸鈉、百里香酚及其復合物對靈武長棗采后主要病原真菌黑根霉、皮落青霉、鏈格孢、粉紅聚端孢的抑菌作用，為可食性的天然保鮮劑在水果采后保鮮上的應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2010年9月在北方民族大學生物學實驗教學示范中心進行。

1.2 試驗材料

試驗所用的4種病原真菌——鏈格孢（Alternaria alternata）、粉紅聚端孢（Trichoderma roseum）、皮落青霉（Penicillium crustosum）、黑根霉（Rhizopus stolonifer）是由本課題組從貯藏的靈武長棗中分離、純化、鑒定后得到。殼聚糖、海藻酸鈉、百里香酚購自北京康貝爾公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液配制 殼聚糖溶液的配制：稱取一定量的殼聚糖，溶于1%乙酸溶液，用1 mol/L NaOH溶液調節pH至5.4；百里香酚溶液的配制：用吐溫-80作乳化劑，溶于水中得百里香酚溶液，調節pH為5.4；海藻酸鈉溶液的配制：稱取一定量的海藻酸鈉，溶于1%乙酸溶液，用1 mol/L NaOH溶液調節pH至5.4；殼聚糖-百里香酚溶液的配制：將配制好的殼聚糖、百里香酚溶液按1∶1（V/V）充分混合，放置2 d，形成穩定溶液（不發生相分離現象，也不發生沉淀和絮凝現象），即得殼聚糖-百里香酚復合物溶液；海藻酸鈉-百里香酚溶液的配制：將配制好的海藻酸鈉、百里香酚溶液按1∶1（V/V）充分混合，放置2 d，形成穩定溶液（不發生相分離現象，也不發生沉淀和絮凝現象），即得海藻酸鈉-百里香酚復合物溶液。

1.3.2 培養基的制備 培養基為PDA培養基[16]。

1.3.3 菌懸液的制備 取4種供試菌分別放入裝有10 mL無菌水的試管中，洗下菌苔，用振蕩器使其混合均勻備用。

1.3.4 最低抑菌濃度的測定 用倍半稀釋法，分別配制濃度為2.000%、1.000%、0.500%、0.250%、0.125%、0.063%、0.031%、0.016%的殼聚糖、海藻酸鈉、百里香酚、殼聚糖-百里香酚、海藻酸鈉-百里香酚的培養基，每濃度重復3次，以無毒培養基為對照。待培養基凝固后，用無菌打孔器打孔，孔徑為5 mm，之后每個濃度分別接入4種供試菌（菌餅反貼法），培養24～72 h，觀察其生長情況，測定菌落直徑，以完全沒有供試菌生長的濃度為該溶液的最低抑菌濃度（MIC）。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖的最低抑菌濃度

由表1可知，不同濃度的殼聚糖對4種供試菌均有不同程度的抑制作用，且隨濃度的增加抑制作用增強。殼聚糖對黑根霉、皮落青霉、鏈格孢、粉紅聚端孢的最低抑菌濃度分別是0.500%、2.000%、0.250%、0.250%。其中殼聚糖對鏈格孢、粉紅聚端孢的最低抑菌濃度相同，均為0.250%，結合菌落直徑，鏈格孢的菌落直徑較粉紅聚端孢的大，說明粉紅聚端孢較鏈格孢容易被抑制；從菌落直徑來看，同一濃度下4種供試菌的菌落直徑由大到小為黑根霉、皮落青霉、鏈格孢、粉紅聚端孢。

2.2 海藻酸鈉的最低抑菌濃度

由表2可見，不同濃度的海藻酸鈉對4種供試菌均有不同程度的抑制作用，且隨濃度的增加抑制作用有所增強。海藻酸鈉對黑根霉的最低抑菌濃度大于2.000%，對皮落青霉、鏈格孢、粉紅聚端孢的最低抑菌濃度分別是2.000%、0.500%、0.500%，其中海藻酸鈉對鏈格孢、粉紅聚端孢的最低抑菌濃度相同，均為0.500%，但從菌落生長情況來看，二者的菌落直徑并不相同，粉紅聚端孢的菌落直徑小于鏈格孢的，說明粉紅聚端孢較之鏈格孢容易被抑制。

2.3 百里香酚的最低抑菌濃度

由表3可見，不同濃度的百里香酚對4種供試菌均有不同程度的抑制作用，且隨濃度的增加抑制作用有所增強。百里香酚對黑根霉、皮落青霉、鏈格孢、粉紅聚端孢的最低抑菌濃度分別是0.063%、0.063%、0.031%、0.031%，其中百里香酚對黑根霉、皮落青霉的最低抑菌濃度均為0.063%，對鏈格孢、粉紅聚端孢的最低抑菌濃度均為0.031%，但從菌落生長情況來看，黑根霉的菌落直徑比皮落青霉的大，鏈格孢的菌落直徑比粉紅聚端孢的大，說明皮落青霉比黑根霉容易被抑制，粉紅聚端孢比鏈格孢容易被抑制。總體看來，同一濃度下4種供試菌的菌落直徑由大到小為黑根霉、皮落青霉、鏈格孢、粉紅聚端孢。

2.4 殼-百復合物的最低抑菌濃度

由表4可見，不同濃度的殼-百復合物對4種供試菌均有不同程度的抑制作用，且隨濃度的增加抑制作用有所增強。殼-百復合物對黑根霉、皮落青霉、鏈格孢、粉紅聚端孢的最低抑菌濃度分別是0.063%、0.063%、0.031%、0.031%，其中殼-百復合物對黑根霉、皮落青霉的最低抑菌濃度均為0.063%，對鏈格孢、粉紅聚端孢的最低抑菌濃度均為0.031%，但從菌落生長情況來看，黑根霉的菌落直徑比皮落青霉的大，鏈格孢的菌落直徑比粉紅聚端孢的大，說明皮落青霉比黑根霉容易受抑制，粉紅聚端孢比鏈格孢容易受抑制。同一濃度下4種供試菌的菌落直徑由大到小為黑根霉、皮落青霉、鏈格孢、粉紅聚端孢。說明4供試菌受抑制的程度由易到難是粉紅聚端孢、鏈格孢、皮落青霉、黑根霉。

2.5 海-百復合物的最低抑菌濃度

由表5可見，不同濃度的海-百復合物對4種供試菌均有不同程度的抑制作用，且隨濃度的增加抑制作用有所增強。海-百復合物對黑根霉、皮落青霉、鏈格孢、粉紅聚端孢的最低抑菌濃度分別是0.063%、0.063%、0.031%、0.031%，其中海-百復合物對黑根霉、皮落青霉的最低抑菌濃度均為0.063%，對鏈格孢、粉紅聚端孢的最低抑菌濃度均為0.031%，但從菌落生長情況來看，黑根霉的菌落直徑比皮落青霉的大，鏈格孢的菌落直徑比粉紅聚端孢的大，說明皮落青霉比黑根霉容易受抑制，粉紅聚端孢比鏈格孢容易受抑制。同一濃度下4種供試菌的菌落直徑由大到小為黑根霉、皮落青霉、鏈格孢、粉紅聚端孢。說明4供試菌受抑制的程度由易到難是粉紅聚端孢、鏈格孢、皮落青霉、黑根霉。

3 結論與討論

有研究表明，殼聚糖、百里香酚均具有一定的抑菌活性，劉鋒等[17]、鐘秋平等[18]、謝東鋒等[19]分別探討了殼聚糖對紐荷爾臍橙、芒果、厚皮甜瓜果實的抑菌作用；張靜等[14]則用百里香酚對10種植物病原菌的抑菌活性進行了研究。海藻酸鈉也有一定的抑菌作用，其抑菌機理有待進一步探討。由本試驗結果可知，殼聚糖、海藻酸鈉、百里香酚及復合物對靈武長棗采后主要病原真菌都有不同程度的抑制作用，其中殼聚糖、海藻酸鈉、百里香酚3種單體對靈武長棗采后4種病原真菌黑根霉、皮落青霉、鏈格孢、粉紅聚端孢的最低抑菌濃度由小到大依次為百里香酚、殼聚糖、海藻酸鈉（其中殼聚糖對黑根霉、皮落青霉、鏈格孢、粉紅聚端孢的最低抑菌濃度分別是0.500%、2.000%、0.250%、0.250%，海藻酸鈉的為大于2.000%、2.000%、0.500%、0.500%，百里香酚的為0.063%、0.063%、0.031%、0.031%），說明其對靈武長棗采后主要病原真菌的抑制作用由強到弱依次為百里香酚、殼聚糖、海藻酸鈉。

殼-百復合物、海-百復合物對黑根霉、皮落青霉、鏈格孢、粉紅聚端孢的最低抑菌濃度均為0.063%、0.063%、0.031%、0.031%，對照上述殼聚糖、海藻酸鈉兩種單體對4種供試菌的最低抑菌濃度可知，殼-百復合物、海-百復合物的最低抑菌濃度均小于殼聚糖、海藻酸鈉單體，說明殼-百復合物、海-百復合物對4種供試菌的抑制作用比同濃度的殼聚糖、海藻酸鈉單體抑制效果好，這與胡瑛等[15]的研究結論一致。

殼聚糖、海藻酸鈉、百里香酚及其復合物對靈武長棗采后主要病原真菌都有一定的抑制作用，在靈武長棗采后病害生物防治的應用上具有較大的潛力。由殼聚糖、海藻酸鈉、百里香酚、殼-百復合物、海-百復合物對4種供試菌的最低抑菌濃度可以推薦其生物防治時的參考濃度，其中，殼聚糖對靈武長棗采后主要病原真菌進行生物防治時的濃度可以選擇為≥2.000%、海藻酸鈉的濃度為 >2.000%，百里香酚及其與殼聚糖、海藻酸鈉復合物濃度為≥0.063%。

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